Nid oes gan glefyd Alzheimer (AD) biofarcwyr protein sy'n adlewyrchu ei bathoffisioleg sylfaenol lluosog, gan rwystro cynnydd diagnosis a thriniaeth. Yma, rydym yn defnyddio proteomeg gynhwysfawr i nodi biomarcwyr hylif serebro-sbinol (CSF) sy'n cynrychioli ystod eang o bathoffisioleg AD. Nododd sbectrometreg màs amlblecs tua 3,500 a thua 12,000 o broteinau yn AD CSF a'r ymennydd, yn y drefn honno. Datrysodd dadansoddiad rhwydwaith o broteom yr ymennydd 44 modiwl bioamrywiaeth, gyda 15 ohonynt yn gorgyffwrdd â'r proteome hylif serebro-sbinol. Mae'r marcwyr AD CSF yn y modiwlau gorgyffwrdd hyn yn cael eu plygu i bum grŵp protein, sy'n cynrychioli gwahanol brosesau pathoffisiolegol. Mae'r synapsau a'r metabolion yn yr ymennydd AD yn lleihau, ond mae'r CSF yn cynyddu, tra bod y myelination llawn glial a'r grwpiau imiwnedd yn yr ymennydd a CSF yn cynyddu. Cadarnhawyd cysondeb a phenodoldeb afiechyd y newidiadau i'r panel mewn mwy na 500 o samplau CSF ychwanegol. Nododd y grwpiau hyn hefyd is-grwpiau biolegol mewn OC asymptomatig. Yn gyffredinol, mae'r canlyniadau hyn yn gam addawol tuag at offer biofarciwr ar y we ar gyfer cymwysiadau clinigol mewn AD.
Clefyd Alzheimer (AD) yw achos mwyaf cyffredin dementia niwroddirywiol ledled y byd ac fe'i nodweddir gan ystod eang o gamweithrediadau system fiolegol, gan gynnwys trosglwyddiad synaptig, imiwnedd glial-gyfryngol, a metaboledd mitocondriaidd (1-3). Fodd bynnag, mae ei biomarcwyr protein sefydledig yn dal i ganolbwyntio ar ganfod amyloid a phrotein tau, ac felly ni allant adlewyrchu'r pathoffisioleg amrywiol hon. Mae'r biomarcwyr protein “craidd” hyn sy'n cael eu mesur yn fwyaf dibynadwy mewn hylif serebro-sbinol (CSF) yn cynnwys (i) peptid beta amyloid 1-42 (Aβ1-42), sy'n adlewyrchu ffurfiant placiau amyloid cortigol; (ii) tau llwyr, arwydd o ddirywiad acson; (iii) phospho-tau (p-tau), cynrychiolydd o hyperffosfforyleiddiad tau patholegol (4-7). Er bod y biomarcwyr hylif serebro-sbinol hyn wedi hwyluso ein canfod o glefydau protein AD “wedi'u marcio” (4-7) yn fawr, dim ond rhan fach o'r fioleg gymhleth y tu ôl i'r afiechyd y maent yn ei gynrychioli.
Mae diffyg amrywiaeth pathoffisiolegol biomarcwyr AD wedi arwain at lawer o heriau, gan gynnwys (i) yr anallu i nodi a meintioli heterogenedd biolegol cleifion AD, (ii) mesur annigonol o ddifrifoldeb a dilyniant afiechyd, yn enwedig yn y cyfnod rhag-glinigol, A ( iii) datblygiad cyffuriau therapiwtig a fethodd â datrys pob agwedd ar ddirywiad niwrolegol yn llwyr. Mae ein dibyniaeth ar batholeg nodedig i ddisgrifio treulio anaerobig o glefydau cysylltiedig yn gwaethygu'r problemau hyn yn unig. Mae mwy a mwy o dystiolaeth yn dangos bod gan y rhan fwyaf o bobl oedrannus â dementia fwy nag un nodwedd patholegol o ddirywiad gwybyddol (8). Mae gan gymaint â 90% neu fwy o unigolion â phatholeg AD hefyd glefyd fasgwlaidd, cynhwysiant TDP-43, neu glefydau dirywiol eraill (9). Mae’r cyfrannau uchel hyn o orgyffwrdd patholegol wedi amharu ar ein fframwaith diagnostig presennol ar gyfer dementia, ac mae angen diffiniad pathoffisiolegol mwy cynhwysfawr o’r clefyd.
Yn wyneb yr angen dybryd am amrywiaeth o fiofarcwyr AD, mae'r maes yn mabwysiadu'r dull “omics” yn gynyddol yn seiliedig ar y system gyffredinol i ddarganfod biofarcwyr. Lansiwyd y Gynghrair Partneriaeth Fferyllol Gyflym (AMP)-AD yn 2014 ac mae ar flaen y gad yn y rhaglen. Nod yr ymdrech amlddisgyblaethol hon gan y Sefydliadau Iechyd Cenedlaethol, y byd academaidd a diwydiant yw defnyddio strategaethau sy'n seiliedig ar system i ddiffinio pathoffisioleg AD yn well a datblygu strategaethau dadansoddi a thrin diagnostig bioamrywiaeth (10). Fel rhan o'r prosiect hwn, mae proteomeg rhwydwaith wedi dod yn arf addawol ar gyfer hyrwyddo biofarcwyr system yn AD. Mae'r dull diduedd hwn sy'n cael ei yrru gan ddata yn trefnu setiau data proteomeg cymhleth yn grwpiau neu “fodiwlau” o broteinau wedi'u cyd-fynegi sy'n gysylltiedig â mathau penodol o gelloedd, organynnau, a swyddogaethau biolegol (11-13). Mae bron i 12 o astudiaethau proteomeg rhwydwaith llawn gwybodaeth wedi'u cynnal ar yr ymennydd AD (13-23). Ar y cyfan, mae'r dadansoddiadau hyn yn dangos bod proteome rhwydwaith ymennydd AD yn cynnal sefydliad modiwlaidd hynod warchodedig mewn carfannau annibynnol a rhanbarthau cortigol lluosog. Yn ogystal, mae rhai o'r modiwlau hyn yn dangos newidiadau atgenhedlu mewn helaethrwydd sy'n gysylltiedig ag AD ar draws setiau data, gan adlewyrchu pathoffisioleg clefydau lluosog. Gyda'i gilydd, mae'r canfyddiadau hyn yn dangos pwynt angor addawol ar gyfer darganfod proteome rhwydwaith yr ymennydd fel biomarcwr seiliedig ar system yn AD.
Er mwyn trawsnewid proteome rhwydwaith ymennydd AD yn fiofarcwyr sy'n ddefnyddiol yn glinigol ar sail system, fe wnaethom gyfuno'r rhwydwaith sy'n deillio o'r ymennydd â'r dadansoddiad proteomig o AD CSF. Arweiniodd y dull integredig hwn at nodi pum set addawol o fiofarcwyr CSF sy'n gysylltiedig ag ystod eang o bathoffisioleg yn seiliedig ar yr ymennydd, gan gynnwys synapsau, pibellau gwaed, myelination, llid, a chamweithrediad llwybrau metabolaidd. Fe wnaethom ddilysu'r paneli biofarcwyr hyn yn llwyddiannus trwy ddadansoddiadau ailadrodd lluosog, gan gynnwys mwy na 500 o samplau CSF o amrywiol glefydau niwroddirywiol. Mae'r dadansoddiadau dilysu hyn yn cynnwys archwilio targedau grŵp yn y CSF o gleifion ag AD asymptomatig (AsymAD) neu ddangos tystiolaeth o groniad amyloid annormal mewn amgylchedd gwybyddol arferol. Mae'r dadansoddiadau hyn yn amlygu'r heterogenedd biolegol sylweddol yn y boblogaeth AsymAD ac yn nodi marcwyr panel a allai fod yn gallu is-deipio unigolion yng nghamau cynharaf y clefyd. At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn gam allweddol yn natblygiad offer biofarcwr protein yn seiliedig ar systemau lluosog a all ddatrys llawer o'r heriau clinigol a wynebir gan AD yn llwyddiannus.
Prif bwrpas yr astudiaeth hon yw nodi biomarcwyr hylif serebro-sbinol newydd sy'n adlewyrchu pathoffisioleg amrywiol yn seiliedig ar yr ymennydd sy'n arwain at AD. Mae Ffigur S1 yn amlinellu ein methodoleg ymchwil, sy'n cynnwys (i) dadansoddiad cynhwysfawr wedi'i ysgogi gan ganfyddiadau rhagarweiniol AD CSF a phroteome ymennydd rhwydwaith i nodi biomarcwyr clefyd CSF lluosog sy'n gysylltiedig â'r ymennydd, a (ii) atgynhyrchu dilynol Mae'r biomarcwyr hyn mewn sawl cerebro-sbinol annibynnol carfanau hylifol. Dechreuodd yr ymchwil sy'n canolbwyntio ar ddarganfyddiad gyda dadansoddiad o fynegiant gwahaniaethol CSF mewn 20 o unigolion gwybyddol normal ac 20 o gleifion AD yng Nghanolfan Ymchwil Clefyd Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). Diffinnir diagnosis o AD fel nam gwybyddol sylweddol ym mhresenoldeb Aβ1-42 isel a lefelau uchel o gyfanswm tau a p-tau yn yr hylif serebro-sbinol [Asesiad Gwybyddol Cymedrig Montreal (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabl S1A). Roedd gan y rheolaeth (MoCA cymedrig, 26.7 ± 2.2) lefelau arferol o fiofarcwyr CSF.
Mae CSF dynol yn cael ei nodweddu gan ystod ddeinamig o ddigonedd protein, lle gall albwmin a phroteinau helaeth iawn eraill atal canfod proteinau o ddiddordeb (24). Er mwyn cynyddu dyfnder y darganfyddiad protein, rydym yn cael gwared ar y 14 proteinau toreithiog iawn cyntaf o bob sampl CSF cyn dadansoddiad sbectrometreg màs (MS) (24). Nodwyd cyfanswm o 39,805 peptidau gan MS, a gafodd eu mapio i 3691 o broteomau mewn 40 sampl. Mae meintioli protein yn cael ei berfformio trwy labelu tag màs tandem lluosog (TMT) (18, 25). Er mwyn datrys y data coll, dim ond y proteinau hynny a fesurwyd mewn o leiaf 50% o'r samplau yn y dadansoddiad dilynol a gynhwyswyd gennym, gan fesur yn olaf 2875 o broteomau. Oherwydd y gwahaniaeth sylweddol yng nghyfanswm lefelau helaethrwydd protein, ystyriwyd yn ystadegol sampl rheoli yn allanolyn (13) ac ni chafodd ei gynnwys yn y dadansoddiad dilynol. Addaswyd gwerthoedd helaethrwydd y 39 sampl sy'n weddill yn ôl oedran, rhyw, a chydamrywiant swp (13-15, 17, 18, 20, 26).
Gan ddefnyddio dadansoddiad prawf-t ystadegol i werthuso mynegiant gwahaniaethol ar y set ddata atchweliad, nododd y dadansoddiad hwn broteinau y newidiwyd eu lefelau helaethrwydd yn sylweddol (P <0.05) rhwng yr achosion rheoli ac AD (Tabl S2A). Fel y dangosir yn Ffigur 1A, gostyngwyd helaethrwydd cyfanswm o 225 o broteinau mewn AD yn sylweddol, a chynyddwyd y doreth o 303 o broteinau yn sylweddol. Mae'r proteinau hyn a fynegir yn wahaniaethol yn cynnwys nifer o farcwyr AD hylif serebro-sbinol a nodwyd yn flaenorol, megis tau protein sy'n gysylltiedig â microtiwb (MAPT; P = 3.52 × 10−8), niwroffilament (NEFL; P = 6.56 × 10−3), Protein sy'n gysylltiedig â thwf 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), Protein Rhwymo Asid Brasterog 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), Chitinase 3 fel 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10−4) a ffactor twf nerfau VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6). Fodd bynnag, fe wnaethom hefyd nodi targedau pwysig iawn eraill, megis atalydd daduniad CMC 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) a rhwymiad calsiwm modiwlaidd sy'n gysylltiedig â SPARC 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9). Datgelodd dadansoddiad Gene Ontology (GO) o 225 o broteinau a leihawyd yn sylweddol gysylltiadau agos â phrosesau hylif y corff megis metaboledd steroid, ceulo gwaed, a gweithgaredd hormonau (Ffigur 1B a Thabl S2B). Mewn cyferbyniad, mae'r cynnydd sylweddol mewn protein o 303 yn gysylltiedig yn agos â strwythur celloedd a metaboledd ynni.
(A) Mae'r plot llosgfynydd yn dangos y newid plyg log2 (echel x) o'i gymharu â'r gwerth P ystadegol -log10 (echelin-y) a gafwyd gan y prawf-t, a ddefnyddir i ganfod mynegiant gwahaniaethol rhwng y rheolaeth (CT) a Achosion AD o'r proteome CSF O'r holl broteinau. Dangosir proteinau â lefelau sylweddol is (P <0.05) mewn OC mewn glas, tra bod proteinau â lefelau sylweddol uwch mewn afiechyd yn cael eu dangos mewn coch. Mae'r protein a ddewiswyd wedi'i labelu. (B) Mae'r termau GO uchaf sy'n ymwneud â phrotein wedi'u lleihau'n sylweddol (glas) a'u cynyddu (coch) mewn AD. Yn dangos y tri therm GO gyda'r sgorau z uchaf ym meysydd prosesau biolegol, swyddogaethau moleciwlaidd, a chydrannau cellog. (C) MS mesur lefel MAPT yn sampl CSF (chwith) a'i gydberthynas â sampl ELISA lefel tau (dde). Dangosir cyfernod cydberthynas Pearson â'r gwerth P perthnasol. Oherwydd diffyg data ELISA ar gyfer un achos treulio anaerobig, mae'r ffigurau hyn yn cynnwys gwerthoedd ar gyfer 38 o'r 39 achos a ddadansoddwyd. (D) Dadansoddiad clwstwr dan oruchwyliaeth (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) wedi'i addasu P <0.01) ar y rheolaeth ac AD CSF canfuwyd samplau gan ddefnyddio'r 65 o broteinau a newidiodd fwyaf arwyddocaol yn y set ddata. Safoni, normaleiddio.
Mae cysylltiad agos rhwng lefel proteomig MAPT a lefel tau ELISA a fesurir yn annibynnol (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; Ffigur 1C), gan gefnogi dilysrwydd ein mesuriad MS. Ar ôl treuliad trypsin ar lefel y protein rhagflaenydd amyloid (APP), ni ellir ïoneiddio'r peptidau isoform-benodol sydd wedi'u mapio i derfynell C Aβ1-40 ac Aβ1-42 yn effeithlon (27, 28). Felly, nid oes gan y peptidau APP a nodwyd gennym unrhyw beth i'w wneud â lefelau ELISA Aβ1-42. Er mwyn gwerthuso mynegiant gwahaniaethol pob achos, fe wnaethom ddefnyddio proteinau a fynegwyd yn wahaniaethol gyda P <0.0001 [cyfradd darganfod ffug (FDR) wedi'i gywiro P <0.01] i berfformio dadansoddiad clwstwr dan oruchwyliaeth o'r samplau (Tabl S2A). Fel y dangosir yn Ffigur 1D, gall y 65 o broteinau hynod arwyddocaol hyn glystyru samplau yn gywir yn ôl cyflwr y clefyd, ac eithrio un achos AD â nodweddion tebyg i reolaeth. O'r 65 o broteinau hyn, cynyddodd 63 yn AD, a dim ond dau (CD74 ac ISLR) a leihaodd. Yn gyfan gwbl, mae'r dadansoddiadau hylif serebro-sbinol hyn wedi nodi cannoedd o broteinau mewn AD a allai wasanaethu fel biomarcwyr afiechyd.
Yna fe wnaethom gynnal dadansoddiad rhwydwaith annibynnol o broteome ymennydd AD. Roedd carfan ymennydd y darganfyddiad hwn yn cynnwys achosion cortecs rhagflaenol dorsolateral (DLPFC) o reolaeth (n = 10), clefyd Parkinson (PD; n = 10), cymysg AD/PD (n = 10) ac AD (n = 10). ) Sampl. Emery Goizueta ADRC. Disgrifiwyd demograffeg y 40 achos hyn yn flaenorol (25) ac fe'u crynhoir yn Nhabl S1B. Fe wnaethom ddefnyddio TMT-MS i ddadansoddi'r 40 meinwe ymennydd hyn a'r garfan atgynhyrchu o 27 o achosion. Yn gyfan gwbl, cynhyrchodd y ddwy set ddata ymennydd hyn 227,121 o peptidau unigryw, a gafodd eu mapio i 12,943 o broteomau (25). Dim ond y proteinau hynny a fesurwyd mewn o leiaf 50% o achosion a gafodd eu cynnwys mewn ymchwiliadau dilynol. Mae'r set ddata darganfyddiad derfynol yn cynnwys 8817 o broteinau meintiol. Addaswch lefelau helaethrwydd protein yn seiliedig ar oedran, rhyw, a chyfnod post-mortem (PMI). Dangosodd y dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol o'r set ddata ar ôl atchweliad fod lefelau protein> 2000 wedi'u newid yn sylweddol [P <0.05, dadansoddiad o amrywiant (ANOVA)] mewn dwy garfan afiechyd neu fwy. Yna, gwnaethom gynnal dadansoddiad clwstwr dan oruchwyliaeth yn seiliedig ar y proteinau a fynegwyd yn wahaniaethol, a P <0.0001 mewn cymariaethau AD/rheolaeth a/neu AD/PD (Ffigur S2, A a B, Tabl S2C). Mae'r 165 o broteinau hynod newidiol hyn yn dangos yn glir achosion â phatholeg AD o'r samplau rheoli a PD, gan gadarnhau'r newidiadau cryf sy'n benodol i AD yn y proteome cyfan.
Yna fe wnaethom ddefnyddio algorithm o'r enw Dadansoddiad Rhwydwaith Cydfynegiant Gene Pwysol (WGCNA) i berfformio dadansoddiad rhwydwaith ar broteome ymennydd a ddarganfuwyd, sy'n trefnu'r set ddata yn fodiwlau protein gyda phatrymau mynegiant tebyg (11-13). Nododd y dadansoddiad 44 o fodiwlau (M) proteinau wedi'u cyd-fynegi, wedi'u didoli a'u rhifo o'r mwyaf (M1, n = proteinau 1821) i'r lleiaf (M44, n = 34 protein) (Ffigur 2A a Thabl S2D). Fel y crybwyllwyd uchod (13) Cyfrifwch broffil mynegiant cynrychioliadol neu brotein nodweddiadol pob modiwl, a'i gydberthynas â chyflwr afiechyd a phatholeg AD, hynny yw, sefydlu cynghrair Cofrestrfa Clefyd Alzheimer (CERAD) a Sgôr Braak (Ffigur 2B). Yn gyffredinol, roedd 17 o fodiwlau yn ymwneud yn sylweddol â niwropatholeg AD (P <0.05). Mae llawer o'r modiwlau hyn sy'n ymwneud â chlefydau hefyd yn gyfoethog mewn marcwyr math-benodol o gelloedd (Ffigur 2B). Fel y soniwyd uchod (13), mae cyfoethogi math o gell yn cael ei bennu trwy ddadansoddi'r gorgyffwrdd modiwl a'r rhestr gyfeirio o enynnau math-benodol cell. Mae'r genynnau hyn yn deillio o ddata cyhoeddedig mewn niwronau llygoden ynysig, celloedd endothelaidd a glial. RNA dilyniannu (RNA-seq) arbrawf (29).
(A) Darganfyddwch WGCNA proteom yr ymennydd. (B) Dadansoddiad o'r protein llofnod modiwlaidd (BiCor) o'r protein llofnod modiwlaidd (y brif elfen gyntaf o fynegiant protein modiwlaidd) gyda nodweddion niwropatholegol AD (brig), gan gynnwys sgorau CERAD (plac Aβ) a Braak (tau tangle). Dangosir dwyster cydberthnasau positif (coch) a negyddol (glas) gan fap gwres dau-liw, ac mae sêr yn dynodi arwyddocâd ystadegol (P <0.05). Defnyddiwch Union Brawf Hypergeometric Fisher (FET) (gwaelod) i asesu cysylltiad math celloedd pob modiwl protein. Mae dwyster y lliwio coch yn nodi faint o gyfoethogi math o gelloedd, ac mae'r seren yn nodi arwyddocâd ystadegol (P <0.05). Defnyddiwch y dull BH i gywiro'r gwerth P sy'n deillio o'r FET. (C) Dadansoddiad GO o broteinau modiwlaidd. Dangosir y prosesau biolegol sydd â'r cysylltiad agosaf ar gyfer pob modiwl neu grŵp modiwl cysylltiedig. oligo, oligodendrocyte.
Dangosodd set o bum modiwl astrocyte a microglia-gyfoethog cysylltiedig (M30, M29, M18, M24, a M5) gydberthynas gadarnhaol gref â niwropatholeg AD (Ffigur 2B). Mae dadansoddiad ontoleg yn cysylltu'r modiwlau glial hyn â thwf celloedd, ymlediad, ac imiwnedd (Ffigur 2C a Thabl S2E). Mae dau fodiwl glial ychwanegol, M8 ac M22, hefyd wedi'u huwchreoleiddio'n gryf mewn clefydau. Mae M8 yn gysylltiedig iawn â'r llwybr derbynnydd tebyg i Doll, rhaeadr signalau sy'n chwarae rhan allweddol yn yr ymateb imiwnedd cynhenid (30). Ar yr un pryd, mae cysylltiad agos rhwng M22 ac addasu ôl-gyfieithu. Mae M2, sy'n gyfoethog mewn oligodendrocytes, yn dangos cydberthynas gadarnhaol gref â phatholeg AD a chysylltiad ontolegol â synthesis niwcleosid ac atgynhyrchu DNA, sy'n nodi cynnydd yn nifer y celloedd mewn clefydau. Ar y cyfan, mae'r canfyddiadau hyn yn cefnogi drychiad modiwlau glial yr ydym wedi arsylwi o'r blaen yn y rhwydwaith proteome AD (13, 17). Ar hyn o bryd canfyddir bod llawer o fodiwlau glial sy'n gysylltiedig ag AD yn y rhwydwaith yn dangos lefelau mynegiant is mewn achosion rheoli ac achosion PD, gan amlygu eu penodolrwydd afiechyd sy'n uwch yn AD (Ffigur S2C).
Dim ond pedwar modiwl yn ein proteome rhwydwaith (M1, M3, M10, a M32) sydd â chydberthynas negyddol gref â phatholeg AD (P <0.05) (Ffigur 2, B ac C). Mae M1 ac M3 yn gyfoethog mewn marcwyr niwronau. Mae M1 yn gysylltiedig iawn â signalau synaptig, tra bod M3 yn perthyn yn agos i swyddogaeth mitocondriaidd. Nid oes tystiolaeth o gyfoethogi math o gelloedd ar gyfer M10 ac M32. Mae M32 yn adlewyrchu'r cysylltiad rhwng M3 a metaboledd celloedd, tra bod M10 yn gysylltiedig iawn â thwf celloedd a swyddogaeth microtiwb. O gymharu ag AD, mae pob un o'r pedwar modiwl yn cynyddu mewn rheolaeth a PD, gan roi newidiadau AD sy'n benodol i'r clefyd iddynt (Ffigur S2C). At ei gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn cefnogi'r niferoedd gostyngol o fodiwlau llawn niwron yr ydym wedi'u harsylwi o'r blaen yn AD (13, 17). I grynhoi, cynhyrchodd y dadansoddiad rhwydwaith o broteome yr ymennydd a ddarganfuwyd gennym fodiwlau a addaswyd yn benodol i AD yn gyson â'n canfyddiadau blaenorol.
Nodweddir AD gan gyfnod asymptomatig cynnar (AsymAD), lle mae unigolion yn arddangos cronni amyloid heb ddirywiad gwybyddol clinigol (5, 31). Mae'r cam asymptomatig hwn yn ffenestr hollbwysig ar gyfer canfod ac ymyrryd yn gynnar. Rydym wedi dangos yn flaenorol cadw modiwlaidd cryf o broteome rhwydwaith ymennydd AsymAD ac AD ar draws setiau data annibynnol (13, 17). Er mwyn sicrhau bod rhwydwaith yr ymennydd y gwnaethom ei ddarganfod ar hyn o bryd yn gyson â'r canfyddiadau blaenorol hyn, dadansoddwyd cadwraeth 44 modiwl yn y set ddata a ddyblygwyd gan 27 o sefydliadau DLPFC. Mae'r sefydliadau hyn yn cynnwys achosion rheoli (n = 10), AsymAD (n = 8 ) ac AD (n = 9). Cynhwyswyd samplau rheoli ac AD yn y dadansoddiad o'n carfan darganfod ymennydd (Tabl S1B), tra bod achosion AsymAD yn unigryw yn y garfan atgynhyrchu yn unig. Daeth yr achosion AsymAD hyn hefyd o fanc ymennydd Emory Goizueta ADRC. Er bod gwybyddiaeth yn normal ar adeg marwolaeth, roedd lefelau amyloid yn annormal o uchel (CERAD cymedrig, 2.8 ± 0.5) (Tabl S1B).
Arweiniodd dadansoddiad TMT-MS o'r 27 meinwe ymennydd hyn at feintioli 11,244 o broteomau. Mae'r cyfrif terfynol hwn yn cynnwys dim ond y proteinau hynny a fesurwyd mewn o leiaf 50% o'r samplau. Mae'r set ddata hon a ailadroddir yn cynnwys 8638 (98.0%) o'r 8817 o broteinau a ganfuwyd yn ein dadansoddiad o ymennydd darganfod, ac mae bron i 3000 o broteinau wedi newid yn sylweddol rhwng y carfannau rheoli ac AD (P <0.05, ar ôl prawf t pâr Tukey ar gyfer dadansoddi amrywiant) ( Tabl S2F). Ymhlith y proteinau hyn a fynegwyd yn wahaniaethol, dangosodd 910 hefyd newidiadau lefel sylweddol rhwng AD ac achosion rheoli proteome ymennydd (P <0.05, ar ôl prawf-t pâr ANOVA Tukey). Mae'n werth nodi bod y marcwyr 910 hyn yn gyson iawn yn y cyfeiriad newid rhwng proteomau (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (Ffigur S3A). Ymhlith y proteinau cynyddol, mae'r proteinau sydd â'r newidiadau mwyaf cyson rhwng setiau data yn bennaf yn aelodau o'r modiwlau M5 a M18 sy'n llawn glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, a GFAP). Ymhlith y proteinau llai, roedd y rhai â'r newidiadau mwyaf cyson bron yn gyfan gwbl yn aelodau o'r modiwl M1 (NPTX2, VGF, a RPH3A) sy'n gysylltiedig â'r synaps. Fe wnaethom ddilysu ymhellach y newidiadau sy'n gysylltiedig ag AD o ganol y cig (MDK), CD44, protein 1 sy'n gysylltiedig â frizzled (SFRP1) a VGF wedi'i secretu trwy blotio gorllewinol (Ffigur S3B). Dangosodd dadansoddiad cadw modiwl fod tua 80% o'r modiwlau protein (34/44) yn y proteome ymennydd wedi'u cadw'n sylweddol yn y set ddata atgynhyrchu (z-score> 1.96, FDR cywiro P <0.05) (Ffigur S3C). Roedd pedwar ar ddeg o'r modiwlau hyn wedi'u neilltuo'n arbennig rhwng y ddau broteom (z-score> 10, FDR wedi'i gywiro P <1.0 × 10−23). Yn gyffredinol, mae darganfod ac atgynhyrchu'r lefel uchel o gysondeb mewn mynegiant gwahaniaethol a chyfansoddiad modiwlaidd rhwng proteome yr ymennydd yn tynnu sylw at atgynhyrchu'r newidiadau mewn proteinau cortecs blaen AD. Yn ogystal, cadarnhaodd hefyd fod gan AsymAD a chlefydau mwy datblygedig strwythur rhwydwaith ymennydd tebyg iawn.
Mae dadansoddiad manylach o'r mynegiant gwahaniaethol yn set ddata atgynhyrchu'r ymennydd yn amlygu'r graddau sylweddol o newidiadau protein AsymAD, gan gynnwys cyfanswm o 151 o broteinau sydd wedi newid yn sylweddol rhwng AsymAD a'r rheolaeth (P <0.05) (Ffigur S3D). Yn gyson â'r llwyth amyloid, cynyddodd APP yn ymennydd AsymAD ac AD yn sylweddol. Dim ond yn OC y mae MAPT yn newid yn sylweddol, sy'n gyson â lefelau uwch o dryslyd a'i gydberthynas hysbys â dirywiad gwybyddol (5, 7). Mae'r modiwlau glial-gyfoethog (M5 a M18) yn cael eu hadlewyrchu'n fawr yn y proteinau cynyddol yn AsymAD, tra bod y modiwl M1 sy'n gysylltiedig â niwronau yw'r mwyaf cynrychioliadol o'r proteinau gostyngol yn AsymAD. Mae llawer o'r marcwyr AsymAD hyn yn dangos mwy o newidiadau mewn clefydau symptomatig. Ymhlith y marcwyr hyn mae SMOC1, protein glial sy'n perthyn i M18, sy'n gysylltiedig â thiwmorau ar yr ymennydd a datblygiad llygaid ac aelodau (32). Mae MDK yn ffactor twf sy'n rhwymo heparin sy'n gysylltiedig â thwf celloedd ac angiogenesis (33), aelod arall o M18. O'i gymharu â'r grŵp rheoli, cynyddodd AsymAD yn sylweddol, ac yna cynnydd mwy mewn AD. Mewn cyferbyniad, gostyngwyd y protein synaptig niwropentraxin 2 (NPTX2) yn sylweddol yn yr ymennydd AsymAD. Roedd NPTX2 yn gysylltiedig yn flaenorol â niwroddirywiad ac mae ganddo rôl gydnabyddedig wrth gyfryngu synapsau cynhyrfus (34). Ar y cyfan, mae'r canlyniadau hyn yn datgelu amrywiaeth o wahanol newidiadau protein preclinical mewn AD sy'n ymddangos fel pe baent yn symud ymlaen gyda difrifoldeb y clefyd.
O ystyried ein bod wedi cyflawni cryn ddyfnder o ran cwmpas protein wrth ddarganfod proteome yr ymennydd, rydym yn ceisio deall yn llawnach ei orgyffwrdd â thrawsgrifiad AD lefel rhwydwaith. Felly, gwnaethom gymharu'r proteome ymennydd a ddarganfuwyd gennym â'r modiwl a gynhyrchwyd gennym yn flaenorol o fesuriad micro-arae o 18,204 o enynnau yn AD (n = 308) a rheolaeth (n = 157) meinweoedd DLPFC (13). gorgyffwrdd. Yn gyfan gwbl, fe wnaethom nodi 20 o fodiwlau RNA gwahanol, llawer ohonynt yn dangos cyfoethogi mathau penodol o gelloedd, gan gynnwys niwronau, oligodendrocytes, astrocytes, a microglia (Ffigur 3A). Dangosir newidiadau lluosog y modiwlau hyn mewn AD yn Ffigur 3B. Yn gyson â'n dadansoddiad gorgyffwrdd protein-RNA blaenorol gan ddefnyddio'r proteome MS dyfnach heb ei labelu (tua 3000 o broteinau) (13), mae'r rhan fwyaf o'r modiwlau 44 yn rhwydwaith proteome yr ymennydd a welsom yn y rhwydwaith transcriptome Nid oes unrhyw orgyffwrdd sylweddol i mewn Hyd yn oed yn ein darganfyddiad a'n dyblygu o'r modiwlau protein 34 sy'n cael eu cadw'n fawr yn y proteome ymennydd, dim ond 14 (~40%) a basiodd union brawf Fisher (FET) a brofodd i fod â gorgyffwrdd ystadegol arwyddocaol â'r trawsgrifiad (Ffigur 3A). Yn cyd-fynd ag atgyweirio difrod DNA (P-M25 a P-M19), cyfieithu protein (P-M7 a P-M20), rhwymo / splicing RNA (P-M16 a P-M21) a thargedu protein (P-M13 a P- M23) yn gorgyffwrdd â modiwlau yn y trawsgrifiad. Felly, er bod set ddata proteome dyfnach yn cael ei ddefnyddio yn y dadansoddiad gorgyffwrdd cyfredol (13), nid yw'r rhan fwyaf o'r proteome rhwydwaith AD wedi'i fapio i'r rhwydwaith trawsgrifio.
(A) Mae FET hypergeometrig yn dangos cyfoethogi marcwyr math-benodol cell ym modiwl RNA y trawsgrifiad AD (top) a graddau'r gorgyffwrdd rhwng modiwlau RNA (echelin-x) a phrotein (echelin-y) yr ymennydd AD. (gwaelod). Mae dwyster y lliwio coch yn nodi faint o gyfoethogi mathau o gelloedd yn y panel uchaf a dwyster gorgyffwrdd y modiwlau yn y panel gwaelod. Mae seren yn dynodi arwyddocâd ystadegol (P <0.05). (B) Y graddau o gydberthynas rhwng genynnau nodweddiadol pob modiwl trawsgrifiad a statws AD. Y modiwlau ar y chwith sydd â'r cydberthynas fwyaf negyddol ag AD (glas), a'r rhai ar y dde sydd â'r cydberthynas fwyaf cadarnhaol ag AD (coch). Mae'r gwerth P wedi'i gywiro gan BH sydd wedi'i drawsnewid gan log yn dangos graddau arwyddocâd ystadegol pob cydberthynas. (C) Modiwlau gorgyffwrdd sylweddol gyda chyfoethogi math o gelloedd a rennir. (D) Dadansoddiad cydberthynas o newid plyg log2 y protein wedi'i labelu (echelin-x) ac RNA (echel-y) yn y modiwl sy'n gorgyffwrdd. Dangosir cyfernod cydberthynas Pearson â'r gwerth P perthnasol. Micro, microglia; cyrff nefol, astrocytes. CT, rheolaeth.
Mae'r rhan fwyaf o fodiwlau protein ac RNA sy'n gorgyffwrdd yn rhannu proffiliau cyfoethogi math o gelloedd tebyg a chyfeiriadau newid AD cyson (Ffigur 3, B ac C). Mewn geiriau eraill, mae’r modiwl M1 sy’n gysylltiedig â synaps o broteom yr ymennydd (PM1) wedi’i fapio i dri modiwl RNA homologaidd llawn niwronaidd (R-M1, R-M9 ac R-M16), sydd yn AD Dangosodd y ddau. lefel is. Yn yr un modd, mae'r modiwlau protein M5 a M18 glial-gyfoethog yn gorgyffwrdd â modiwlau RNA sy'n gyfoethog mewn astrocytes a marcwyr microglial (R-M3, R-M7, ac R-M10) ac maent yn ymwneud yn fawr â chlefydau Cynnydd. Mae'r nodweddion modiwlaidd hyn a rennir rhwng y ddwy set ddata yn cefnogi ymhellach y cyfoethogiad math o gelloedd a'r newidiadau sy'n gysylltiedig â chlefydau yr ydym wedi'u gweld ym mhroffem yr ymennydd. Fodd bynnag, gwelsom lawer o wahaniaethau arwyddocaol rhwng yr RNA a lefelau protein marcwyr unigol yn y modiwlau hyn a rennir. Mae dadansoddiad cydberthynas o fynegiant gwahaniaethol proteomeg a thrawsgrifomeg y moleciwlau o fewn y modiwlau hyn sy'n gorgyffwrdd (Ffigur 3D) yn amlygu'r anghysondeb hwn. Er enghraifft, dangosodd APP a nifer o broteinau modiwl glial eraill (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1, a SFRP1) gynnydd sylweddol yn y proteome AD, ond nid oedd bron unrhyw newid yn y trawsgrifiad AD. Gall y newidiadau hyn sy'n benodol i brotein fod yn gysylltiedig yn agos â phlaciau amyloid (23, 35), gan amlygu'r proteome fel ffynhonnell newidiadau patholegol, ac efallai na fydd y newidiadau hyn yn cael eu hadlewyrchu yn y trawsgrifiad.
Ar ôl dadansoddi proteomau'r ymennydd a CSF yn annibynnol a ddarganfyddwyd gennym, fe wnaethom gynnal dadansoddiad cynhwysfawr o'r ddwy set ddata i nodi biomarcwyr CSF AD sy'n gysylltiedig â phathoffisioleg rhwydwaith yr ymennydd. Rhaid inni ddiffinio gorgyffwrdd y ddau broteom yn gyntaf. Er y derbynnir yn eang bod CSF yn adlewyrchu newidiadau niwrocemegol yn yr ymennydd AD (4), nid yw union raddau'r gorgyffwrdd rhwng yr ymennydd AD a'r proteome CSF yn glir. Trwy gymharu nifer y cynhyrchion genynnau a rennir a ganfuwyd yn ein dau broteom, canfuom fod bron i 70% (n = 1936) o'r proteinau a nodwyd yn yr hylif serebro-sbinol hefyd wedi'u meintioli yn yr ymennydd (Ffigur 4A). Mae'r rhan fwyaf o'r proteinau gorgyffwrdd hyn (n = 1721) wedi'u mapio i un o fodiwlau cyd-fynegiant 44 o set ddata ymennydd darganfod (Ffigur 4B). Yn ôl y disgwyl, y chwe modiwl ymennydd mwyaf (M1 i M6) a ddangosodd y swm mwyaf o orgyffwrdd CSF. Fodd bynnag, mae modiwlau ymennydd llai (er enghraifft, M15 ac M29) sy'n cyflawni lefel annisgwyl o uchel o orgyffwrdd, sy'n fwy na modiwl ymennydd ddwywaith ei faint. Mae hyn yn ein cymell i fabwysiadu dull mwy manwl, wedi'i ysgogi gan ystadegau, i gyfrifo'r gorgyffwrdd rhwng yr ymennydd a hylif serebro-sbinol.
(A a B) Mae'r proteinau a ganfyddir yn yr ymennydd darganfod a setiau data CSF yn gorgyffwrdd. Mae'r rhan fwyaf o'r proteinau gorgyffwrdd hyn yn gysylltiedig ag un o'r 44 modiwl cyd-fynegiant o rwydwaith cydfynegiant yr ymennydd. (C) Darganfyddwch y gorgyffwrdd rhwng y proteome hylif serebro-sbinol a phroteome rhwydwaith yr ymennydd. Mae pob rhes o'r map gwres yn cynrychioli dadansoddiad gorgyffwrdd ar wahân o'r FET hypergeometrig. Mae'r rhes uchaf yn dangos y gorgyffwrdd (lliw llwyd/du) rhwng modiwl yr ymennydd a'r proteome CSF cyfan. Mae'r ail linell yn dangos bod y gorgyffwrdd rhwng modiwlau'r ymennydd a phrotein CSF (wedi'i arlliwio mewn coch) wedi'i uwch-reoleiddio'n sylweddol yn AD (P <0.05). Mae'r trydydd rhes yn dangos bod y gorgyffwrdd rhwng modiwlau'r ymennydd a phrotein CSF (cysgodi glas) wedi'i reoleiddio'n sylweddol yn AD (P <0.05). Defnyddiwch y dull BH i gywiro'r gwerth P sy'n deillio o'r FET. (D) Panel modiwl plygu yn seiliedig ar gymdeithas math cell a thelerau GO cysylltiedig. Mae'r paneli hyn yn cynnwys cyfanswm o 271 o broteinau sy'n gysylltiedig â'r ymennydd, sydd â mynegiant gwahaniaethol ystyrlon yn y proteome CSF.
Gan ddefnyddio FETs un gynffon, fe wnaethom asesu pwysigrwydd gorgyffwrdd protein rhwng y proteome CSF a modiwlau unigol yr ymennydd. Datgelodd y dadansoddiad fod gan gyfanswm o fodiwlau ymennydd 14 yn y set ddata CSF orgyffwrdd ystadegol arwyddocaol (P <0.05 wedi'i addasu gan FDR), a modiwl ychwanegol (M18) y mae ei orgyffwrdd yn agos at arwyddocâd (FDR wedi'i addasu P = 0.06) (Ffigur 4C , rhes uchaf). Mae gennym ddiddordeb hefyd mewn modiwlau sy'n gorgyffwrdd yn gryf â phroteinau CSF a fynegir yn wahaniaethol. Felly, gwnaethom gymhwyso dau ddadansoddiad FET ychwanegol i bennu pa rai o (i) protein CSF a gynyddwyd yn sylweddol mewn AD a (ii) gostyngwyd protein CSF yn sylweddol mewn modiwlau ymennydd AD (P <0.05, prawf pâr t AD/rheolaeth) gyda gorgyffwrdd ystyrlon rhyngddynt. Fel y dangosir yn rhesi canol a gwaelod Ffigur 4C, mae'r dadansoddiadau ychwanegol hyn yn dangos bod 8 o'r 44 modiwl ymennydd yn gorgyffwrdd yn sylweddol â'r protein a ychwanegwyd yn AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, ac M38) . ), tra bod dim ond dau fodiwl (M6 a M15) yn dangos gorgyffwrdd ystyrlon â'r protein llai yn AD CSF. Yn ôl y disgwyl, mae pob un o'r 10 modiwl yn y 15 modiwl gyda'r gorgyffwrdd uchaf â phroteome CSF. Felly, tybiwn fod y 15 modiwl hyn yn ffynonellau cynnyrch uchel o fiomarcwyr CSF sy'n deillio o'r ymennydd AD.
Fe wnaethom blygu'r 15 modiwl gorgyffwrdd hyn yn bum panel protein mawr yn seiliedig ar eu hagosrwydd yn niagram coeden WGCNA a'u cysylltiad â mathau o gelloedd ac ontoleg genynnau (Ffigur 4D). Mae'r panel cyntaf yn cynnwys modiwlau sy'n gyfoethog mewn marcwyr niwron a phroteinau sy'n gysylltiedig â synaps (M1 a M12). Mae'r panel synaptig yn cynnwys cyfanswm o 94 o broteinau, ac mae'r lefelau yn y proteome CSF wedi newid yn sylweddol, gan ei wneud y ffynhonnell fwyaf o farcwyr CSF sy'n gysylltiedig â'r ymennydd ymhlith y pum panel. Dangosodd yr ail grŵp (M6 a M15) y cysylltiad agos â marcwyr celloedd endothelaidd a chorff fasgwlaidd, megis “iachau clwyfau” (M6) a “rheoleiddio ymateb imiwn humoral” (M15). Mae M15 hefyd yn gysylltiedig iawn â metaboledd lipoprotein, sydd â chysylltiad agos ag endotheliwm (36). Mae'r panel fasgwlaidd yn cynnwys 34 o farcwyr CSF sy'n gysylltiedig â'r ymennydd. Mae'r trydydd grŵp yn cynnwys modiwlau (M2 a M4) sy'n gysylltiedig yn sylweddol â marcwyr oligodendrocyte ac amlhau celloedd. Er enghraifft, mae termau ontoleg lefel uchaf M2 yn cynnwys “rheoliad cadarnhaol o ddyblygu DNA” a “proses biosynthesis purin”. Yn y cyfamser, mae rhai M4 yn cynnwys “gwahaniaethu celloedd glial” a “gwahanu cromosomau”. Mae'r panel myelination yn cynnwys 49 o farcwyr CSF sy'n gysylltiedig â'r ymennydd.
Mae'r pedwerydd grŵp yn cynnwys y nifer fwyaf o fodiwlau (M30, M29, M18, M24, ac M5), ac mae bron pob modiwl yn sylweddol gyfoethog mewn microglia a marcwyr astrocyte. Yn debyg i'r panel myelination, mae'r pedwerydd panel hefyd yn cynnwys modiwlau (M30, M29, a M18) sy'n perthyn yn agos i amlhau celloedd. Mae'r modiwlau eraill yn y grŵp hwn yn berthnasol iawn i dermau imiwnolegol, megis “proses effaith imiwn” (M5) a “rheoliad ymateb imiwn” (M24). Mae'r grŵp imiwnedd glial yn cynnwys 42 o farcwyr CSF sy'n gysylltiedig â'r ymennydd. Yn olaf, mae'r panel olaf yn cynnwys 52 o farcwyr sy'n gysylltiedig â'r ymennydd ar y pedwar modiwl (M44, M3, M33, a M38), ac mae pob un ohonynt ar y corff yn ymwneud â storio ynni a metaboledd. Mae'r mwyaf o'r modiwlau hyn (M3) yn perthyn yn agos i mitocondria ac mae'n gyfoethog mewn marcwyr niwronau penodol. Mae M38 yn un o'r aelodau modiwl llai yn y metabolome hwn ac mae hefyd yn arddangos penodoldeb niwronau cymedrol.
Yn gyffredinol, mae'r pum panel hyn yn adlewyrchu ystod eang o fathau o gelloedd a swyddogaethau yn y cortecs AD, ac ar y cyd maent yn cynnwys 271 o farcwyr CSF sy'n gysylltiedig â'r ymennydd (Tabl S2G). Er mwyn gwerthuso dilysrwydd y canlyniadau MS hyn, gwnaethom ddefnyddio'r assay estyniad agosrwydd (PEA), sef technoleg gwrthgyrff orthogonal gyda galluoedd amlblecsio, sensitifrwydd a phenodoldeb uchel, ac ail-ddadansoddi'r samplau hylif serebro-sbinol a welsom Is-set o'r 271 biomarcwyr hyn (n = 36). Mae'r 36 targed hyn yn dangos y newid yn y lluosrif AD o PEA, sydd â chysylltiad agos â'n canfyddiadau ar sail MS (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12), A ddilysodd ganlyniadau ein dadansoddiad MS cynhwysfawr yn gryf (Ffigur S4 ).
Mae'r themâu biolegol a bwysleisiwyd gan ein pum grŵp, o signalau synaptig i fetaboledd ynni, i gyd yn gysylltiedig â pathogenesis AD (1-3). Felly, mae pob un o'r 15 modiwl sy'n cynnwys y paneli hyn yn gysylltiedig â'r patholeg AD yn y proteome ymennydd a ddarganfuwyd gennym (Ffigur 2B). Y mwyaf nodedig yw'r cydberthynas patholegol positif uchel rhwng ein modiwlau glial a'r gydberthynas patholegol negyddol gref rhwng ein modiwlau niwronaidd mwyaf (M1 a M3). Mae dadansoddiad mynegiant gwahaniaethol ein proteome ymennydd a atgynhyrchwyd (Ffigur S3D) hefyd yn amlygu proteinau glial sy'n deillio o M5 a M18. Yn AsymAD ac AD symptomatig, y proteinau glial mwyaf cynyddol a synapsau sy'n gysylltiedig â M1 Y protein sy'n cael ei leihau fwyaf. Mae'r arsylwadau hyn yn dangos bod y 271 o farcwyr hylif serebro-sbinol a nodwyd gennym yn y pum grŵp yn gysylltiedig â phrosesau clefyd yn y cortecs AD, gan gynnwys y rhai sy'n digwydd yn y cyfnodau asymptomatig cynnar.
Er mwyn dadansoddi cyfeiriad newid y proteinau panel yn well yn yr ymennydd a hylif asgwrn cefn, lluniwyd y canlynol gennym ar gyfer pob un o'r 15 modiwl gorgyffwrdd: (i) dod o hyd i lefel helaethrwydd y modiwl yn set ddata'r ymennydd a (ii) y modiwl protein Mynegir y gwahaniaeth yn yr hylif serebro-sbinol (Ffigur S5). Fel y soniwyd yn gynharach, defnyddir WGCNA i bennu digonedd modiwl neu werth protein nodweddiadol yn yr ymennydd (13). Defnyddir y map llosgfynydd i ddisgrifio mynegiant gwahaniaethol proteinau modiwlaidd yn yr hylif serebro-sbinol (AD/control). Mae'r ffigurau hyn yn dangos bod tri o'r pum panel yn dangos tueddiadau mynegiant gwahanol yn hylif yr ymennydd a'r asgwrn cefn. Mae dau fodiwl y panel synaps (M1 a M12) yn dangos gostyngiad yn lefel helaethrwydd yr ymennydd AD, ond yn gorgyffwrdd yn sylweddol â'r cynnydd mewn protein yn yr AD CSF (Ffigur S5A). Roedd y modiwlau cysylltiedig â niwronau sy'n cynnwys y metabolome (M3 a M38) yn dangos patrymau mynegiant hylif ymennydd a serebro-sbinol tebyg yn anghyson (Ffigur S5E). Dangosodd y panel fasgwlaidd hefyd dueddiadau mynegiant gwahanol, er bod ei fodiwlau (M6 a M15) wedi'u cynyddu'n gymedrol yn yr ymennydd AD ac wedi gostwng yn y CSF heintiedig (Ffigur S5B). Mae'r ddau banel arall yn cynnwys rhwydweithiau glial mawr y mae eu proteinau'n cael eu huwchreoleiddio'n gyson yn y ddwy adran (Ffigur S5, C a D).
Sylwch nad yw'r tueddiadau hyn yn gyffredin i bob marciwr yn y paneli hyn. Er enghraifft, mae'r panel synaptig yn cynnwys nifer o broteinau sy'n cael eu lleihau'n sylweddol yn yr ymennydd AD a CSF (Ffigur S5A). Ymhlith y marcwyr hylif serebro-sbinol is-reoleiddiedig hyn mae NPTX2 a VGF o M1, a chromogranin B o M12. Fodd bynnag, er gwaethaf yr eithriadau hyn, mae'r rhan fwyaf o'n marcwyr synaptig yn uchel mewn hylif asgwrn cefn OC. Ar y cyfan, roedd y dadansoddiadau hyn yn gallu gwahaniaethu rhwng tueddiadau ystadegol arwyddocaol yn lefelau hylif yr ymennydd a hylif serebro-sbinol ym mhob un o'n pum panel. Mae'r tueddiadau hyn yn amlygu'r berthynas gymhleth sy'n aml yn wahanol rhwng mynegiant protein yr ymennydd a CSF mewn AD.
Yna, gwnaethom ddefnyddio dadansoddiad atgynhyrchu MS trwybwn uchel (dyblygiad CSF 1) i gyfyngu ein set o 271 o fiofarcwyr i'r targedau mwyaf addawol ac atgenhedlu (Ffigur 5A). Mae copi CSF 1 yn cynnwys cyfanswm o samplau 96 gan Emory Goizueta ADRC, gan gynnwys rheolaeth, AsymAD, a chohort AD (Tabl S1A). Nodweddir yr achosion AD hyn gan ddirywiad gwybyddol ysgafn (MoCA cymedrig, 20.0 ± 3.8), a newidiadau mewn biomarcwyr AD a gadarnhawyd mewn hylif serebro-sbinol (Tabl S1A). Yn groes i'r dadansoddiad CSF a ganfuwyd gennym, mae'r atgynhyrchu hwn yn cael ei berfformio gan ddefnyddio dull MS “un ergyd” mwy effeithlon a thrwybwn (heb ffracsiynu all-lein), gan gynnwys protocol paratoi sampl symlach sy'n dileu'r angen am imiwnedd imiwneiddio samplau unigol. . Yn lle hynny, defnyddir un “sianel gwella” sy'n disbyddu imiwn i chwyddo'r signal o broteinau llai helaeth (37). Er ei fod yn lleihau cyfanswm y cwmpas proteome, mae'r dull un ergyd hwn yn lleihau amser peiriant yn sylweddol ac yn cynyddu nifer y samplau â label TMT y gellir eu dadansoddi'n hyfyw (17, 38). Yn gyfan gwbl, nododd y dadansoddiad 6,487 o beptidau, a oedd yn mapio i 1,183 o broteomau mewn 96 o achosion. Yn yr un modd â'r dadansoddiad CSF a welsom, dim ond y proteinau hynny a fesurwyd mewn o leiaf 50% o'r samplau a gafodd eu cynnwys yn y cyfrifiadau dilynol, a chafodd y data ei atchweliad ar gyfer effeithiau oedran a rhyw. Arweiniodd hyn at feintioli terfynol 792 o broteomau, a nodwyd 95% ohonynt hefyd yn y set ddata CSF a ddarganfuwyd.
(A) Targedau protein CSF sy'n gysylltiedig â'r ymennydd wedi'u gwirio yn y garfan CSF a ailadroddwyd gyntaf a'u cynnwys yn y panel terfynol (n = 60). (B i E) Lefelau biofarcwyr panel (sgoriau z cyfansawdd) wedi'u mesur yn y pedair carfan atgynhyrchu CSF. Defnyddiwyd profion t mewn parau neu ANOVA gydag ôl-gywiriad Tukey i werthuso arwyddocâd ystadegol y newidiadau mewn amlder ym mhob dadansoddiad a atgynhyrchwyd. CT, rheolaeth.
Gan fod gennym ddiddordeb arbennig mewn gwirio ein 271 o dargedau CSF sy'n ymwneud â'r ymennydd trwy ddadansoddiad cynhwysfawr, byddwn yn cyfyngu ar archwilio'r proteome hwn ymhellach i'r marcwyr hyn. Ymhlith y 271 o broteinau hyn, canfuwyd 100 yn atgynhyrchiad CSF 1. Mae Ffigur S6A yn dangos mynegiant gwahaniaethol y 100 o farcwyr gorgyffwrdd hyn rhwng y samplau rheoli ac atgynhyrchu AD. Histones synaptig a metabolit sy'n cynyddu fwyaf mewn AD, tra bod proteinau fasgwlaidd yn lleihau fwyaf mewn afiechyd. Cadwodd y rhan fwyaf o'r 100 marciwr gorgyffwrdd (n = 70) yr un cyfeiriad newid yn y ddwy set ddata (Ffigur S6B). Mae'r 70 o farcwyr CSF dilys sy'n gysylltiedig â'r ymennydd (Tabl S2H) yn adlewyrchu i raddau helaeth y tueddiadau mynegiant panel a welwyd yn flaenorol, hynny yw, is-reoleiddio proteinau fasgwlaidd ac uwch-reoleiddio pob panel arall. Dim ond 10 o'r 70 o broteinau dilys hyn a ddangosodd newidiadau mewn helaethrwydd AD a oedd yn gwrth-ddweud y tueddiadau panel hyn. Er mwyn cynhyrchu panel sy'n adlewyrchu orau duedd gyffredinol yr ymennydd a hylif serebro-sbinol, gwnaethom eithrio'r 10 protein hyn o'r panel diddordeb y gwnaethom ei wirio o'r diwedd (Ffigur 5A). Felly, mae ein panel yn y pen draw yn cynnwys cyfanswm o 60 o broteinau wedi'u gwirio mewn dwy garfan AD CSF annibynnol gan ddefnyddio gwahanol baratoi sampl a dadansoddiad platfform MS. Cadarnhaodd plotiau mynegiant sgôr z y paneli terfynol hyn yn yr achosion rheoli copi 1 CSF ac AD y duedd panel a welwyd yn y garfan CSF a welsom (Ffigur 5B).
Ymhlith y 60 protein hyn, mae moleciwlau y gwyddys eu bod yn gysylltiedig ag AD, fel osteopontin (SPP1), sy'n cytocin pro-llidiol sydd wedi bod yn gysylltiedig ag AD mewn llawer o astudiaethau (39-41), a GAP43, protein synaptig. mae hynny'n amlwg yn gysylltiedig â niwroddirywiad (42). Y proteinau sydd wedi'u dilysu fwyaf yw marcwyr sy'n gysylltiedig â chlefydau niwroddirywiol eraill, megis sglerosis ochrol amyotroffig (ALS) superoxide dismutase 1 (SOD1) sy'n gysylltiedig â chlefyd Parkinson a desaccharase sy'n gysylltiedig â chlefyd Parkinson (PARK7). Rydym hefyd wedi gwirio bod llawer o farcwyr eraill, megis SMOC1 a phrotein signalau atodi pilen llawn ymennydd 1 (BASP1), wedi cyfyngu ar gysylltiadau blaenorol â niwroddirywiad. Mae'n werth nodi, oherwydd eu niferoedd cyffredinol isel yn y proteome CSF, ei bod yn anodd i ni ddefnyddio'r dull canfod un ergyd trwybwn uchel hwn i ganfod MAPT a rhai proteinau eraill sy'n gysylltiedig ag AD yn ddibynadwy (er enghraifft, NEFL a NRGN ) ( 43, 44).
Yna fe wnaethom wirio'r 60 o farcwyr panel blaenoriaeth hyn mewn tri dadansoddiad ychwanegol wedi'u dyblygu. Yn CSF Copy 2, fe wnaethom ddefnyddio un TMT-MS i ddadansoddi carfan annibynnol o 297 o samplau rheoli ac AD gan Emory Goizueta ADRC (17). Roedd atgynhyrchu CSF 3 yn cynnwys ail-ddadansoddiad o'r data TMT-MS sydd ar gael gan gleifion rheoli 120 ac AD o Lausanne, y Swistir (45). Canfuwyd mwy na dwy ran o dair o'r 60 o farcwyr blaenoriaeth ym mhob set ddata. Er bod astudiaeth y Swistir yn defnyddio gwahanol lwyfannau MS a dulliau meintioli TMT (45, 46), fe wnaethom atgynhyrchu ein tueddiadau panel yn gryf mewn dau ddadansoddiad ailadroddus (Ffigur 5, C a D, a Thablau S2, I, a J). I werthuso penodolrwydd afiechyd ein grŵp, fe wnaethom ddefnyddio TMT-MS i ddadansoddi'r bedwaredd set ddata atgynhyrchu (dyblygiad CSF 4), a oedd yn cynnwys nid yn unig achosion rheoli (n = 18) ac AD (n = 17), ond hefyd achosion PD ( n = 14)), samplau ALS (n = 18) a dementia frontotemporal (FTD) (n = 11) (Tabl S1A). Llwyddwyd i fesur bron i ddwy ran o dair o'r proteinau panel yn y garfan hon (38 allan o 60). Mae'r canlyniadau hyn yn amlygu'r newidiadau AD-benodol ym mhob un o'r pum panel biofarcwr (Ffigur 5E a Thabl S2K). Dangosodd y cynnydd yn y grŵp metabolit y penodolrwydd AD cryfaf, ac yna'r grŵp myelination a glial. I raddau llai, mae FTD hefyd yn dangos cynnydd rhwng y paneli hyn, a allai adlewyrchu newidiadau rhwydwaith posibl tebyg (17). Mewn cyferbyniad, dangosodd ALS a PD bron yr un proffiliau myelination, glial, a metabolome â'r grŵp rheoli. Yn gyffredinol, er gwaethaf gwahaniaethau mewn paratoi samplau, platfform MS, a dulliau meintioli TMT, mae'r dadansoddiadau ailadroddus hyn yn dangos bod gan ein marcwyr panel blaenoriaeth newidiadau hynod gyson o AD-benodol mewn mwy na 500 o samplau CSF unigryw.
Mae niwroddirywiad AD wedi cael ei gydnabod yn eang sawl blwyddyn cyn i symptomau gwybyddol ddechrau, felly mae angen biomarcwyr AsymAD ar frys (5, 31). Fodd bynnag, mae mwy a mwy o dystiolaeth yn dangos bod bioleg AsymAD ymhell o fod yn homogenaidd, ac mae'r rhyngweithio cymhleth o risg a gwytnwch yn arwain at wahaniaethau unigol mawr mewn dilyniant afiechyd dilynol (47). Er ei fod yn cael ei ddefnyddio i nodi achosion AsymAD, nid yw lefelau biomarcwyr CSF craidd (Aβ1-42, cyfanswm tau a p-tau) wedi profi eu bod yn gallu rhagweld yn ddibynadwy pwy fydd yn symud ymlaen i ddementia (4, 7), gan nodi mwy o bosibl. angenrheidiol i gynnwys offer biofarcwr cyfannol yn seiliedig ar agweddau lluosog ar ffisioleg yr ymennydd i haenu risg y boblogaeth hon yn gywir. Felly, fe wnaethom ddadansoddi ein panel biomarcwyr a ddilyswyd gan AD yn y boblogaeth AsymAD o gopi CSF 1. Dangosodd y 31 achos AsymAD hyn lefelau biomarcwr craidd annormal (cymhareb Aβ1-42/cyfanswm tau ELISA, <5.5) a gwybyddiaeth gyflawn (cymedr MoCA, 27.1). ± 2.2) (Tabl S1A). Yn ogystal, mae gan bob unigolyn ag AsymAD sgôr dementia clinigol o 0, sy'n dangos nad oes tystiolaeth o ddirywiad mewn perfformiad gwybyddol neu ymarferol dyddiol.
Yn gyntaf, dadansoddwyd lefelau'r paneli dilysedig ym mhob un o'r 96 copi CSF o 1, gan gynnwys carfan AsymAD. Canfuom fod gan sawl panel yn y grŵp AsymAD newidiadau sylweddol tebyg i AD, dangosodd y panel fasgwlaidd duedd ar i lawr yn AsymAD, tra bod pob panel arall yn dangos tuedd ar i fyny (Ffigur 6A). Felly, dangosodd pob panel gydberthynas hynod arwyddocaol ag ELISA Aβ1-42 a chyfanswm lefelau tau (Ffigur 6B). Mewn cyferbyniad, mae'r gydberthynas rhwng y grŵp a'r sgôr MoCA yn gymharol wael. Un o'r canfyddiadau mwyaf trawiadol o'r dadansoddiadau hyn yw'r ystod eang o gyflenwadau paneli yng ngharfan AsymAD. Fel y dangosir yn Ffigur 6A, mae lefel panel y grŵp AsymAD fel arfer yn croesi lefel panel y grŵp rheoli a'r grŵp AD, gan ddangos amrywioldeb cymharol uchel. Er mwyn archwilio'r heterogenedd hwn o AsymAD ymhellach, cymhwyswyd dadansoddiad Graddio Amlddimensiwn (MDS) i 96 o achosion atgynhyrchu CSF 1. Mae dadansoddiad ISD yn caniatáu delweddu'r tebygrwydd rhwng achosion yn seiliedig ar newidynnau penodol yn y set ddata. Ar gyfer y dadansoddiad clwstwr hwn, rydym ond yn defnyddio'r marcwyr panel dilys hynny sydd â newid ystadegol arwyddocaol (P <0.05, AD/rheolaeth) yn lefel darganfod ac atgynhyrchu CSF 1 proteome (n = 29) (Tabl S2L). Cynhyrchodd y dadansoddiad hwn glystyru gofodol clir rhwng ein hachosion rheoli ac achosion treulio anaerobig (Ffigur 6C). Mewn cyferbyniad, mae rhai achosion AsymAD wedi'u clystyru'n glir yn y grŵp rheoli, tra bod eraill wedi'u lleoli mewn achosion AD. Er mwyn archwilio'r heterogenedd AsymAD hwn ymhellach, defnyddiwyd ein map ISD i ddiffinio dau grŵp o'r achosion AsymAD hyn. Roedd y grŵp cyntaf yn cynnwys achosion AsymAD wedi'u clystyru'n agosach at y rheolaeth (n = 19), tra bod yr ail grŵp wedi'i nodweddu gan achosion AsymAD gyda phroffil marciwr yn agosach at AD (n = 12).
(A) Lefel mynegiant (z-sgôr) y grŵp biomarcwyr CSF ym mhob un o'r 96 sampl yn y garfan atgynhyrchu CSF 1, gan gynnwys AsymAD. Defnyddiwyd dadansoddiad o amrywiant ag ôl-gywiriad Tukey i werthuso arwyddocâd ystadegol newidiadau helaethrwydd paneli. (B) Dadansoddiad cydberthynas o lefel digonedd protein panel (z-sgôr) gyda sgôr MoCA a chyfanswm lefel tau yn samplau copi 1 ELISA Aβ1-42 a CSF. Dangosir cyfernod cydberthynas Pearson â'r gwerth P perthnasol. (C) Seiliwyd ISD 96 achos copi 1 CSF ar lefelau helaethrwydd 29 o farcwyr panel dilys, a newidiwyd yn sylweddol yn y setiau data darganfod a chopi CSF 1 [P <0.05 AD/rheolaeth (CT)]. Defnyddiwyd y dadansoddiad hwn i rannu'r grŵp AsymAD yn is-grwpiau rheoli (n = 19) ac AD (n = 12). (D) Mae'r plot llosgfynydd yn dangos mynegiant gwahaniaethol holl broteinau atgynhyrchu CSF 1 gyda newid plyg log2 (echelin-x) o'i gymharu â gwerth P ystadegol -log10 rhwng y ddau is-grŵp AsymAD. Mae biofarcwyr y panel wedi'u lliwio. (E) CSF atgynhyrchu 1 lefel amlder y grŵp dethol biofarcwyr yn cael eu mynegi'n wahaniaethol rhwng is-grwpiau AsymAD. Defnyddiwyd dadansoddiad ôl-addasedig Tukey o amrywiant i asesu arwyddocâd ystadegol.
Fe wnaethom archwilio'r mynegiant protein gwahaniaethol rhwng yr achosion rheoli hyn ac achosion AsymAD tebyg i AD (Ffigur 6D a Thabl S2L). Mae'r map llosgfynydd a ddeilliodd o hyn yn dangos bod 14 o farcwyr panel wedi newid yn sylweddol rhwng y ddau grŵp. Mae'r rhan fwyaf o'r marcwyr hyn yn aelodau o'r synaps a'r metabolom. Fodd bynnag, mae swbstrad kinase C protein SOD1 a myristoylated alanine-gyfoethog (MARCKS), sy'n aelodau o'r grwpiau imiwnedd myelin a glial, yn y drefn honno, hefyd yn perthyn i'r grŵp hwn (Ffigur 6, D ac E). Cyfrannodd y panel fasgwlaidd hefyd ddau farciwr a gafodd eu lleihau'n sylweddol yn y grŵp AsymAD tebyg i AD, gan gynnwys protein rhwymo AE 1 (AEBP1) ac sy'n ategu aelod o'r teulu C9. Nid oedd gwahaniaeth arwyddocaol rhwng yr is-grwpiau rheoli ac AsymAD tebyg i AD yn ELISA AB1-42 (P = 0.38) a p-tau (P = 0.28), ond yn wir roedd gwahaniaeth sylweddol yng nghyfanswm y lefel tau (P = 0.0031). ) (Ffig. S7). Mae yna nifer o farcwyr panel sy'n nodi bod y newidiadau rhwng y ddau is-grŵp AsymAD yn fwy arwyddocaol na chyfanswm y lefelau tau (er enghraifft, YWHAZ, SOD1, a MDH1) (Ffigur 6E). Yn gyffredinol, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall ein panel dilysedig gynnwys biofarcwyr a all isdeipio a haeniad risg posibl cleifion â chlefyd asymptomatig.
Mae angen dybryd am offer biofarcwr system i fesur a thargedu'r pathoffisioleg amrywiol y tu ôl i AD yn well. Disgwylir i'r offer hyn nid yn unig newid ein fframwaith diagnostig AD, ond hefyd hyrwyddo mabwysiadu strategaethau triniaeth effeithiol, penodol i gleifion (1, 2). I'r perwyl hwn, gwnaethom gymhwyso dull proteomeg cynhwysfawr diduedd i AD ymennydd a CSF i nodi biomarcwyr CSF ar y we sy'n adlewyrchu ystod eang o bathoffisioleg yn seiliedig ar yr ymennydd. Cynhyrchodd ein dadansoddiad bum panel biofarcwr CSF, sydd (i) yn adlewyrchu synapsau, pibellau gwaed, myelin, camweithrediad imiwnedd a metabolaidd; (ii) dangos atgynhyrchedd cryf ar lwyfannau MS gwahanol; (iii) Dangos newidiadau cynyddol clefyd-benodol yn ystod cyfnodau cynnar a hwyr AD. Ar y cyfan, mae'r canfyddiadau hyn yn cynrychioli cam addawol tuag at ddatblygu offer biofarciwr amrywiol, dibynadwy, sy'n canolbwyntio ar y we ar gyfer ymchwil AD a chymwysiadau clinigol.
Mae ein canlyniadau'n dangos trefniadaeth hynod warchodedig proteome rhwydwaith ymennydd AD ac yn cefnogi ei ddefnydd fel angor ar gyfer datblygu biomarcwyr yn seiliedig ar system. Mae ein dadansoddiad yn dangos bod gan ddwy set ddata TMT-MS annibynnol sy'n cynnwys ymennydd AD ac AsymAD fodiwlaidd cryf. Mae'r canfyddiadau hyn yn ymestyn ein gwaith blaenorol, gan ddangos cadwraeth y modiwlau pwerus o fwy na 2,000 o feinweoedd ymennydd o garfanau annibynnol lluosog yn y cortecs blaen, parietal, ac amser (17). Mae'r rhwydwaith consensws hwn yn adlewyrchu'r newidiadau amrywiol sy'n gysylltiedig â chlefydau a welwyd mewn ymchwil gyfredol, gan gynnwys y cynnydd mewn modiwlau llidiol llawn glial a gostyngiad mewn modiwlau sy'n llawn niwronau. Fel ymchwil gyfredol, mae'r rhwydwaith hwn ar raddfa fawr hefyd yn cynnwys newidiadau modiwlaidd sylweddol yn AsymAD, gan ddangos amrywiaeth o wahanol pathoffisioleg rag-glinigol (17).
Fodd bynnag, o fewn y fframwaith hynod geidwadol hwn sy'n seiliedig ar systemau, mae heterogenedd biolegol mwy manwl, yn enwedig ymhlith unigolion yng nghamau cynnar AD. Mae ein panel biomarcwyr yn gallu darlunio dau is-grŵp yn AsymAD, sy'n dangos y mynegiant gwahaniaethol sylweddol o farcwyr CSF lluosog. Roedd ein grŵp yn gallu tynnu sylw at y gwahaniaethau biolegol rhwng y ddau is-grŵp hyn, nad oedd yn amlwg ar lefel biofarcwyr craidd AD. O gymharu â'r grŵp rheoli, roedd cymarebau Aβ1-42/cyfanswm tau yr unigolion AsymAD hyn yn annormal o isel. Fodd bynnag, dim ond cyfanswm y lefelau tau oedd yn sylweddol wahanol rhwng y ddau is-grŵp AsymAD, tra bod y lefelau Aβ1-42 a p-tau yn parhau'n gymharol debyg. Gan ei bod yn ymddangos bod tau CSF uchel yn rhagfynegydd gwell o symptomau gwybyddol na lefelau Aβ1-42 (7), rydym yn amau y gallai fod gan y ddwy garfan AsymAD risgiau gwahanol o ddatblygiad afiechyd. O ystyried maint sampl cyfyngedig ein AsymAD a'r diffyg data hydredol, mae angen ymchwil pellach i ddod i'r casgliadau hyn yn hyderus. Fodd bynnag, mae'r canlyniadau hyn yn dangos y gall panel CSF sy'n seiliedig ar system wella ein gallu i haenu unigolion yn effeithiol yn ystod cam asymptomatig y clefyd.
Yn gyffredinol, mae ein canfyddiadau yn cefnogi rôl swyddogaethau biolegol lluosog yn pathogenesis AD. Fodd bynnag, daeth metaboledd ynni wedi'i ddadreoleiddio yn thema amlwg ym mhob un o'n pum panel labelu dilys. Proteinau metabolaidd, fel hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) a lactate dehydrogenase A (LDHA), yw'r biomarcwyr synaptig a ddilyswyd yn fwyaf cadarn, sy'n nodi bod y cynnydd mewn AD CSF yn rhyw atgynhyrchadwy iawn. Mae ein pibellau gwaed a'n paneli glial hefyd yn cynnwys nifer o farcwyr sy'n ymwneud â metaboledd sylweddau ocsideiddiol. Mae'r canfyddiadau hyn yn gyson â'r rôl allweddol y mae prosesau metabolaidd yn ei chwarae yn yr ymennydd cyfan, nid yn unig i gwrdd â galw ynni uchel niwronau, ond hefyd i gwrdd â galw ynni uchel astrocytes a chelloedd glial eraill (17, 48). Mae ein canlyniadau'n cefnogi tystiolaeth gynyddol y gallai newidiadau mewn potensial rhydocs ac ymyrraeth ar lwybrau ynni fod yn gyswllt craidd rhwng sawl proses allweddol sy'n ymwneud â phathogenesis AD, gan gynnwys anhwylderau mitocondriaidd, llid wedi'i gyfryngu gan glial, a difrod Fasgwlaidd (49). Yn ogystal, mae'r biomarcwyr hylif serebro-sbinol metabolig yn cynnwys nifer fawr o broteinau gwahaniaethol gyfoethog rhwng ein rheolaeth ac is-grwpiau AsymAD tebyg i AD, sy'n awgrymu y gallai tarfu ar y llwybrau egni a rhydocs hyn fod yn hollbwysig yng nghyfnod preclinical y clefyd.
Mae gan y gwahanol dueddiadau panel hylif ymennydd a serebro-sbinol a welsom hefyd oblygiadau biolegol diddorol. Mae synapsau a metabolomau sy'n llawn niwronau yn dangos lefelau is yn yr ymennydd AD a mwy o hylif serebro-sbinol. O ystyried bod niwronau'n gyfoethog mewn mitocondria sy'n cynhyrchu ynni mewn synapsau i ddarparu egni ar gyfer eu signalau arbenigol niferus (50), disgwylir tebygrwydd proffiliau mynegiant y ddau grŵp niwron hyn. Gall colli niwronau ac allwthio celloedd sydd wedi'u difrodi esbonio'r tueddiadau panel ymennydd a CSF hyn mewn afiechyd diweddarach, ond ni allant esbonio'r newidiadau panel cynnar a welwn (13). Un esboniad posibl am y canfyddiadau hyn mewn clefyd asymptomatig cynnar yw tocio synaptig annormal. Mae tystiolaeth newydd mewn modelau llygoden yn awgrymu y gallai ffagocytosis synaptig wedi'i gyfryngu â microglia gael ei actifadu'n annormal yn AD ac arwain at golli synaps cynnar yn yr ymennydd (51). Gall y deunydd synaptig hwn a daflwyd gronni yn CSF, a dyna pam yr ydym yn arsylwi ar y cynnydd mewn CSF yn y panel niwron. Gall tocio synaptig trwy imiwn hefyd esbonio'n rhannol y cynnydd mewn proteinau glial a welwn yn yr ymennydd a hylif serebro-sbinol trwy gydol y broses afiechyd. Yn ogystal â thocio synaptig, gall annormaleddau cyffredinol yn y llwybr ecsocytig hefyd arwain at wahanol ymadroddion ymennydd a CSF o farcwyr niwronau. Mae nifer o astudiaethau wedi dangos bod cynnwys exosomes yn pathogenesis ymennydd AD wedi newid (52). Mae'r llwybr allgellog hefyd yn ymwneud ag amlder Aβ (53, 54). Mae'n werth nodi y gallai atal secretiad ecsosomaidd leihau patholeg tebyg i OC mewn modelau llygoden trawsenynnol AD (55).
Ar yr un pryd, dangosodd y protein yn y panel fasgwlaidd gynnydd cymedrol yn yr ymennydd AD, ond gostyngodd yn sylweddol yn y CSF. Gall camweithrediad rhwystr gwaed-ymennydd (BBB) esbonio'r canfyddiadau hyn yn rhannol. Mae llawer o astudiaethau dynol postmortem annibynnol wedi dangos dadansoddiad o BBB yn AD (56, 57). Cadarnhaodd yr astudiaethau hyn amrywiol weithgareddau annormal yn ymwneud â'r haen hon o gelloedd endothelaidd sydd wedi'i selio'n dynn, gan gynnwys gollyngiadau capilari'r ymennydd a chroniad perifasgwlaidd o broteinau a gludir yn y gwaed (57). Gall hyn roi esboniad syml am y proteinau fasgwlaidd uchel yn yr ymennydd, ond ni all esbonio'n llawn ddisbyddiad yr un proteinau hyn yn yr hylif serebro-sbinol. Un posibilrwydd yw bod y system nerfol ganolog wrthi'n ynysu'r moleciwlau hyn i ddatrys y broblem o lid cynyddol a straen ocsideiddiol. Mae'r gostyngiad yn rhai o'r proteinau CSF mwyaf difrifol yn y panel hwn, yn enwedig y rhai sy'n ymwneud â rheoleiddio lipoprotein, yn gysylltiedig ag atal lefelau niweidiol o lid a'r broses niwro-amddiffynnol o rywogaethau ocsigen adweithiol. Mae hyn yn wir am Paroxonase 1 (PON1), ensym rhwymo lipoprotein sy'n gyfrifol am leihau lefelau straen ocsideiddiol yn y cylchrediad (58, 59). Mae rhagflaenydd alffa-1-microglobwlin/bikunin (AMBP) yn farciwr arall sydd wedi'i is-reoleiddio'n sylweddol o'r grŵp fasgwlaidd. Mae'n rhagflaenydd y bikunin cludwr lipid, sydd hefyd yn ymwneud ag atal llid ac Amddiffyn niwrolegol (60, 61).
Er gwaethaf damcaniaethau diddorol amrywiol, mae'r anallu i ganfod mecanweithiau clefyd biocemegol yn uniongyrchol yn gyfyngiad adnabyddus ar ddadansoddiad proteomeg sy'n cael ei yrru gan ddarganfyddiad. Felly, mae angen ymchwil pellach i ddiffinio'n hyderus y mecanweithiau y tu ôl i'r paneli biofarcwyr hyn. Er mwyn symud tuag at ddatblygu dadansoddiad clinigol ar sail MS, mae cyfeiriad y dyfodol hefyd yn gofyn am ddefnyddio dulliau meintiol wedi'u targedu ar gyfer gwirio biomarcwyr ar raddfa fawr, megis monitro adwaith dethol neu gyfochrog (62). Yn ddiweddar, fe wnaethom ddefnyddio monitro adwaith cyfochrog (63) i ddilysu llawer o'r newidiadau protein CSF a ddisgrifir yma. Mae nifer o dargedau panel blaenoriaeth yn cael eu mesur yn fanwl gywir, gan gynnwys YWHAZ, ALDOA, a SMOC1, sy'n mapio i'n paneli synaps, metaboledd a llid, yn y drefn honno (63). Gall Caffael Data Annibynnol (DIA) a strategaethau eraill sy'n seiliedig ar MS fod yn ddefnyddiol hefyd ar gyfer dilysu targedau. Mae Bud et al. (64) Dangoswyd yn ddiweddar bod gorgyffwrdd sylweddol rhwng y biomarcwyr AD a nodwyd yn ein set ddata darganfod CSF a’r set ddata DIA-MS annibynnol, sy’n cynnwys bron i 200 o samplau CSF o dair carfan Ewropeaidd wahanol. Mae'r astudiaethau diweddar hyn yn cefnogi potensial ein paneli i drawsnewid yn ganfodyddion dibynadwy sy'n seiliedig ar MS. Mae canfod gwrthgyrff traddodiadol ac atamer hefyd yn bwysig ar gyfer datblygiad pellach biomarcwyr AD allweddol. Oherwydd y niferoedd isel o CSF, mae'n anoddach canfod y biomarcwyr hyn gan ddefnyddio dulliau MS trwybwn uchel. Mae NEFL a NRGN yn ddwy enghraifft o’r fath o fiofarcwyr CSF nifer isel, sydd wedi’u mapio i’r panel yn ein dadansoddiad cynhwysfawr, ond na ellir eu canfod yn ddibynadwy gan ddefnyddio ein strategaeth MS sengl. Gall targedu strategaethau sy'n seiliedig ar wrthgyrff lluosog, fel PEA, hyrwyddo trawsnewid clinigol y marcwyr hyn.
Yn gyffredinol, mae'r astudiaeth hon yn darparu dull proteomeg unigryw ar gyfer adnabod a gwirio biofarcwyr CSF AD yn seiliedig ar wahanol systemau. Gallai optimeiddio'r paneli marcio hyn ar draws carfannau AD ychwanegol a llwyfannau MS fod yn addawol i ddatblygu haeniad a thriniaeth risg AD. Mae astudiaethau sy'n gwerthuso lefel hydredol y paneli hyn dros amser hefyd yn hanfodol i benderfynu pa gyfuniad o farcwyr sy'n haenu orau'r risg o glefyd cynnar a newidiadau mewn difrifoldeb afiechyd.
Ac eithrio'r 3 sampl a gopïwyd gan CSF, casglwyd yr holl samplau CSF a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon o dan nawdd Emory ADRC neu sefydliadau ymchwil â chysylltiad agos. Defnyddiwyd cyfanswm o bedair set o samplau Emory CSF yn yr astudiaethau proteomeg hyn. Canfuwyd bod y garfan CSF yn cynnwys samplau o 20 rheolydd iach ac 20 o gleifion AD. Mae copi CSF 1 yn cynnwys samplau o 32 o reolaethau iach, 31 o unigolion AsymAD, a 33 o unigolion AD. Mae copi CSF 2 yn cynnwys 147 o reolaethau a 150 o samplau OC. Roedd carfan atgynhyrchu 4 CSF aml-glefyd yn cynnwys 18 o fesurau rheoli, 17 OC, 19 ALS, 13 PD, ac 11 sampl FTD. Yn ôl y cytundeb a gymeradwywyd gan Fwrdd Adolygu Sefydliadol Prifysgol Emory, cafodd holl gyfranogwyr astudiaeth Emory ganiatâd gwybodus. Yn ôl Canllawiau Arfer Gorau 2014 y Sefydliad Cenedlaethol Heneiddio ar gyfer Canolfannau Alzheimer (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), casglwyd hylif serebro-sbinol a'i storio trwy dyllu meingefnol. Derbyniodd cleifion Rheoli ac AsymAD ac AD asesiad gwybyddol safonol yng Nghlinig Niwroleg Wybyddol Emory neu Goizueta ADRC. Profwyd eu samplau hylif serebro-sbinol gan INNO-BIA AlzBio3 Luminex ar gyfer ELISA Aβ1-42, cyfanswm dadansoddiad tau a p-tau (65 ). Defnyddir gwerthoedd ELISA i gefnogi dosbarthiad diagnostig pynciau yn seiliedig ar feini prawf torbwynt biofarciwr AD sefydledig (66, 67). Ceir data demograffig a diagnostig sylfaenol ar gyfer diagnosisau CSF eraill (FTD, ALS, a PD) hefyd gan Emory ADRC neu sefydliadau ymchwil cysylltiedig. Mae'r metadata achos cryno ar gyfer yr achosion Emory CSF hyn i'w weld yn Nhabl S1A. Mae nodweddion carfan atgynhyrchu 3 CSF y Swistir wedi'u cyhoeddi'n flaenorol (45).
Daeth CSF o hyd i'r sampl. Er mwyn cynyddu dyfnder ein darganfyddiad o'r set ddata CSF, perfformiwyd defnydd imiwnedd o broteinau helaeth iawn cyn trypsineiddio. Yn fyr, gosodwyd 130 μl o CSF o 40 sampl CSF unigol a chyfaint cyfartal (130 μl) o Resin Dihysbyddu Protein Digonedd Dewis Uchel Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) mewn colofn sbin (Thermo Fisher Scientific, A89868) yn yr ystafell tymheredd Deori). Ar ôl troelli am 15 munud, centrifuge y sampl ar 1000g am 2 funud. Defnyddiwyd dyfais hidlo ultracentrifugal 3K (Millipore, UFC500396) i grynhoi'r sampl elifiant trwy allgyrchu ar 14,000g am 30 munud. Gwanhewch holl gyfeintiau'r sampl i 75 μl gyda halwynog wedi'i glustogi â ffosffad. Gwerthuswyd y crynodiad protein gan y dull asid bicinchoninic (BCA) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Thermo Fisher Scientific). Treuliwyd y CSF wedi'i imiwneiddio (60 μl) o bob un o'r 40 sampl â lysyl endopeptidase (LysC) a trypsin. Yn fyr, gostyngwyd y sampl a'i alkylated gyda 1.2 μl 0.5 M tris-2 (-carboxyethyl)-phosphine a 3 μl 0.8 M cloroacetamide ar 90 ° C am 10 munud, ac yna sonicated mewn baddon dŵr am 15 munud. Gwanhawyd y sampl gyda byffer wrea 193 μl 8 M [8 M wrea a 100 mM NaHPO4 (pH 8.5)] i grynodiad terfynol o 6 M wrea. Defnyddir LysC (4.5 μg; Wako) ar gyfer treulio dros nos ar dymheredd ystafell. Yna cafodd y sampl ei wanhau i 1 M wrea gyda 50 mM amoniwm bicarbonad (ABC) (68). Ychwanegwch swm cyfartal (4.5 μg) o trypsin (Promega), ac yna deorwch y sampl am 12 awr. Asideiddio'r hydoddiant peptid wedi'i dreulio i grynodiad terfynol o 1% asid fformig (FA) a 0.1% asid trifluoroacetig (TFA) (66), ac yna dihalwyn gyda cholofn Sep-Pak C18 50 mg (Dyfroedd) fel y disgrifir uchod (25) . Yna cafodd y peptid ei eludo mewn 1 ml o 50% acetonitrile (ACN). Er mwyn safoni meintioli protein ar draws sypiau (25), cyfunwyd 100 μl aliquots o bob un o'r 40 sampl CSF i gynhyrchu sampl cymysg, a rannwyd wedyn yn bum sampl safon fewnol fyd-eang (GIS) (48). Mae'r holl samplau unigol a safonau cyfun yn cael eu sychu gan wactod cyflym (Labconco).
Mae CSF yn copïo'r sampl. Mae Dayon a chydweithwyr wedi disgrifio disbyddiad imiwnedd a threulio samplau copi CSF 3 yn flaenorol (45, 46). Nid oedd y samplau a atgynhyrchwyd sy'n weddill wedi'u himiwneiddio'n unigol. Treuliwch y samplau hyn heb eu tynnu mewn trypsin fel y disgrifiwyd yn flaenorol (17). Ar gyfer pob dadansoddiad dro ar ôl tro, cafodd 120 μl aliquots o'r peptid eliwiedig o bob sampl eu cronni gyda'i gilydd a'u rhannu'n aliquots cyfaint cyfartal i'w defnyddio fel y safon fewnol fyd-eang wedi'i labelu gan TMT (48). Mae'r holl samplau unigol a safonau cyfun yn cael eu sychu gan wactod cyflym (Labconco). Er mwyn gwella signal y protein CSF swm isel, trwy gyfuno 125 μl o bob sampl, paratowyd sampl “gwell” ar gyfer pob dadansoddiad a ddyblygwyd [hy, sampl biolegol sy'n dynwared y sampl ymchwil, ond y swm sydd ar gael yw llawer mwy (37, 69)] wedi'u huno i sampl CSF cymysg (17). Yna cafodd y sampl cymysg ei thynnu imiwn gan ddefnyddio 12 ml o Resin Tynnu Protein Digonedd o Dethol Uchel 14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), wedi'i dreulio fel y disgrifir uchod, a'i gynnwys yn y labelu TMT lluosog dilynol.
Amser postio: Awst-27-2021