Diolch am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod yn defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn gwneud y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Mae thermoffiliau yn ficro-organebau sy'n ffynnu ar dymheredd uchel. Gall eu hastudio roi gwybodaeth werthfawr am sut mae bywyd yn addasu i amodau eithafol. Fodd bynnag, mae'n anodd cyflawni amodau tymheredd uchel gyda microsgopau optegol confensiynol. Mae nifer o atebion cartref yn seiliedig ar wresogi trydanol gwrthiannol lleol wedi'u cynnig, ond nid oes ateb masnachol syml. Yn y papur hwn, rydym yn cyflwyno'r cysyniad o wresogi laser microscale dros faes golygfa microsgop i ddarparu tymheredd uchel ar gyfer astudiaethau thermoffilig tra'n cadw amgylchedd y defnyddiwr yn ysgafn. Gellir cyflawni gwresogi microscale ar ddwysedd laser cymedrol gan ddefnyddio swbstrad wedi'i orchuddio â nanoronynnau aur fel amsugnwr golau biocompatible ac effeithlon. Trafodir effeithiau posibl darfudiad hylif microscale, cadw celloedd, a mudiant thermofforetig allgyrchol. Mae'r dull wedi'i arddangos mewn dwy rywogaeth: (i) Geobacillus stearothermophilus, bacteriwm thermoffilig gweithredol sy'n atgenhedlu ar tua 65°C, yr ydym wedi sylwi ei fod yn egino, yn tyfu ac yn nofio o dan wresogi ar raddfa ficro; (ii) Thiobacillus sp., archaea hyperthermophilic optimaidd. ar 80°C. Mae'r gwaith hwn yn paratoi'r ffordd ar gyfer arsylwi syml a diogel ar ficro-organebau thermoffilig gan ddefnyddio offer microsgopeg modern a fforddiadwy.
Dros biliynau o flynyddoedd, mae bywyd ar y Ddaear wedi esblygu i addasu i ystod eang o amodau amgylcheddol a ystyrir weithiau yn eithafol o'n safbwynt dynol. Yn benodol, mae rhai micro-organebau thermoffilig (bacteria, archaea, ffyngau) a elwir yn thermoffiliau yn ffynnu yn yr ystod tymheredd o 45 ° C i 122 ° C1, 2, 3, 4. Mae thermoffiliau'n byw mewn amrywiol ecosystemau, megis fentiau hydrothermol môr dwfn, ffynhonnau poeth neu ardaloedd folcanig. Mae eu hymchwil wedi ennyn llawer o ddiddordeb dros y degawdau diwethaf am o leiaf ddau reswm. Yn gyntaf, gallwn ddysgu oddi wrthynt, er enghraifft, sut mae thermoffiliau 5, 6, ensymau 7, 8 a philenni 9 yn sefydlog ar dymheredd mor uchel, neu sut y gall thermoffiliau wrthsefyll lefelau eithafol o ymbelydredd10. Yn ail, maent yn sail i lawer o gymwysiadau biotechnolegol pwysig1,11,12 megis cynhyrchu tanwydd13,14,15,16, synthesis cemegol (dihydro, alcoholau, methan, asidau amino, ac ati)17, bio-fwyngloddio18 a biocatalysyddion thermostable7 ,11, 13. Yn benodol, mae'r adwaith cadwynol polymeras (PCR)19 adnabyddus ar hyn o bryd yn cynnwys ensym (Taq polymeras) wedi'i ynysu o'r bacteriwm thermoffilig Thermus aquaticus, un o'r thermoffiliau cyntaf i'w ddarganfod.
Fodd bynnag, nid yw astudio thermoffiliau yn dasg hawdd ac ni ellir ei wneud yn fyrfyfyr mewn unrhyw labordy biolegol. Yn benodol, ni ellir arsylwi thermoffiliau byw mewn vitro gydag unrhyw ficrosgop golau safonol, hyd yn oed gyda siambrau gwresogi sydd ar gael yn fasnachol, sydd fel arfer wedi'u graddio ar gyfer tymheredd mor isel â 40 ° C. Ers y 1990au, dim ond ychydig o grwpiau ymchwil sydd wedi ymroi i gyflwyno systemau microsgopeg tymheredd uchel (HTM). Yn 1994 Glukh et al. Lluniwyd y siambr wresogi/oeri yn seiliedig ar y defnydd o gell Peltier sy'n rheoli tymheredd capilarïau hirsgwar sydd wedi'u cau i gynnal anaerobigedd 20 . Gellir gwresogi'r ddyfais hyd at 100 ° C ar gyfradd o 2 ° C/s, gan ganiatáu i'r awduron astudio symudoldeb y bacteriwm hyperthermophilic Thermotoga maritima21. Yn 1999 Horn et al. Mae dyfais debyg iawn wedi'i datblygu, sy'n dal i fod yn seiliedig ar ddefnyddio capilarïau wedi'u gwresogi sy'n addas ar gyfer microsgopeg masnachol i astudio cellraniad/cysylltiad. Ar ôl cyfnod hir o anweithgarwch cymharol, ailddechreuodd y gwaith o chwilio am HTMs effeithiol yn 2012, yn enwedig mewn cysylltiad â chyfres o bapurau gan grŵp Wirth a ddefnyddiodd ddyfais a ddyfeisiwyd gan Horn et al. Bymtheg mlynedd yn ôl, astudiwyd symudedd nifer fawr o archaea, gan gynnwys hyperthermophiles, ar dymheredd hyd at 100°C gan ddefnyddio capilarïau wedi’u gwresogi23,24. Fe wnaethant hefyd addasu'r microsgop gwreiddiol i gyflawni gwresogi cyflymach (sawl munud yn lle 35 munud i gyrraedd y tymheredd gosodedig) a chyflawni graddiant tymheredd llinellol o fwy na 2 cm ar draws y cyfrwng. Defnyddiwyd y ddyfais siapio graddiant tymheredd hwn (TGFD) i astudio symudedd llawer o thermoffiliau o fewn graddiannau tymheredd ar bellteroedd biolegol berthnasol 24, 25 .
Nid gwresogi capilarïau caeedig yw'r unig ffordd i arsylwi thermoffiliau byw. Yn 2012, Kuwabara et al. Defnyddiwyd siambrau Pyrex tafladwy cartref wedi'u selio â glud sy'n gwrthsefyll gwres (Super X2; Cemedine, Japan). Rhoddwyd y samplau ar blât gwresogi tryloyw sydd ar gael yn fasnachol (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) sy'n gallu gwresogi hyd at 110 ° C, ond nad oedd wedi'i fwriadu'n wreiddiol ar gyfer bioddelweddu. Sylwodd yr awduron ar raniad effeithlon o facteria thermoffilig anaerobig (Thermosipho globiformans, gan ddyblu amser 24 munud) ar 65 ° C. Yn 2020, mae Pulshen et al. Dangoswyd gwresogi llestri metel masnachol yn effeithlon (AttofluorTM, Thermofisher) gan ddefnyddio dwy elfen wresogi cartref: caead a llwyfan (cyfluniad wedi'i ysbrydoli gan beiriant PCR). Mae'r cysylltiad hwn yn arwain at dymheredd hylif unffurf ac yn atal anweddiad ac anwedd ar waelod y caead. Mae'r defnydd o O-ring yn osgoi cyfnewid nwy gyda'r amgylchedd. Defnyddiwyd yr HTM hwn, a elwir yn Sulfoscope, i ddelweddu Sulfolobus acidocaldarius ar 75°C27.
Un cyfyngiad cydnabyddedig ar yr holl systemau hyn oedd y cyfyngiad ar y defnydd o amcanion aer, gydag unrhyw drochiad olew yn anaddas ar gyfer tymheredd mor uchel ac ar gyfer delweddu trwy samplau tryloyw >1-mm o drwch. Un cyfyngiad cydnabyddedig ar yr holl systemau hyn oedd y cyfyngiad ar y defnydd o amcanion aer, gydag unrhyw drochiad olew yn anaddas ar gyfer tymheredd mor uchel ac ar gyfer delweddu trwy samplau tryloyw >1-mm o drwch. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушныъекопо imersionnое погружение масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализароцези ы толщиной > 1 мм. Un o ddiffygion cydnabyddedig yr holl systemau hyn oedd y cyfyngiad ar y defnydd o amcanion aer, gan nad oedd unrhyw drochi olew yn addas ar gyfer tymheredd mor uchel ac ar gyfer delweddu trwy samplau tryloyw > 1 mm o drwch.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合空造油浸都不适合空造油浸都不适合空造米厚的透明样品成像。 Cyfyngiad cydnabyddedig o'r holl systemau hyn yw'r cyfyngiad ar ddefnyddio drych wedi'i gludo gan aer, gan fod unrhyw drochiad olew yn anaddas ar gyfer delweddu samplau tryloyw > 1 mm o drwch ar dymheredd mor uchel. Общепризнанным недостатком всех этих систе ввллетсраниченое исползовзовни byd вррзоонown, ружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализацииver Anfantais gydnabyddedig yr holl systemau hyn yw'r defnydd cyfyngedig o lensys aer, mae unrhyw drochi olew yn anaddas ar gyfer tymereddau mor uchel a delweddu trwy samplau tryloyw > 1 mm o drwch.Yn fwy diweddar, codwyd y cyfyngiad hwn gan Charles-Orzag et al. 28, a ddatblygodd ddyfais nad yw bellach yn darparu gwres o amgylch y system o ddiddordeb, ond yn hytrach y tu mewn i'r gwydr clawr ei hun, wedi'i orchuddio â haen dryloyw denau o wrthydd wedi'i wneud o ITO (indium-tun ocsid). Gellir cynhesu'r caead hyd at 75 ° C trwy basio cerrynt trydan trwy'r haen dryloyw. Fodd bynnag, rhaid i'r awdur hefyd gynhesu'r lens i'r amcan, ond dim mwy na 65 ° C, er mwyn peidio â'i niweidio.
Mae'r gweithiau hyn yn dangos nad yw datblygiad microsgopeg optegol tymheredd uchel effeithlon wedi'i fabwysiadu'n eang, yn aml mae angen offer cartref, ac fe'i cyflawnir yn aml ar gost datrysiad gofodol, sy'n anfantais ddifrifol o ystyried nad yw micro-organebau thermoffilig yn fwy nag ychydig. micromedrau. Llai o gyfaint gwresogi yw'r allwedd i ddatrys tair problem gynhenid HTM: datrysiad gofodol gwael, syrthni thermol uchel pan fydd y system yn cynhesu, a gwresogi niweidiol yr elfennau cyfagos (olew trochi, lens gwrthrychol ... neu ddwylo'r defnyddiwr) ar dymheredd eithafol. ).
Yn y papur hwn, rydym yn cyflwyno HTM ar gyfer arsylwi thermoffilig nad yw'n seiliedig ar wresogi gwrthiannol. Yn lle hynny, fe wnaethom gyflawni gwresogi lleol o fewn rhan gyfyngedig o faes golygfa'r microsgop trwy arbelydru laser o swbstrad sy'n amsugno golau. Delweddwyd y dosbarthiad tymheredd gan ddefnyddio microsgopeg cyfnod meintiol (QPM). Mae effeithiolrwydd y dull hwn yn cael ei ddangos gan Geobacillus stearothermophilus, bacteriwm thermoffilig symudol sy'n atgynhyrchu tua 65 ° C ac sydd ag amser dyblu byr (tua 20 munud), a Sulfolobus shibatae, hyperthermophile sy'n tyfu optimaidd ar 80 ° C (archaea). i ddarlunio. Arsylwyd cyfradd atgynhyrchu arferol a nofio fel swyddogaeth tymheredd. Nid yw'r HTM laser hwn (LA-HTM) wedi'i gyfyngu gan drwch y slip gorchuddio na natur yr amcan (trochi aer neu olew). Mae hyn yn caniatáu i unrhyw lens cydraniad uchel ar y farchnad gael ei ddefnyddio. Nid yw ychwaith yn dioddef o wresogi araf oherwydd syrthni thermol (yn cyflawni gwresogi ar unwaith ar raddfa milieiliad) ac yn defnyddio cydrannau sydd ar gael yn fasnachol yn unig. Mae'r unig bryderon diogelwch newydd yn ymwneud â phresenoldeb trawstiau laser pwerus (hyd at 100 mW fel arfer) y tu mewn i'r ddyfais ac o bosibl trwy'r llygaid, sydd angen gogls amddiffynnol.
Egwyddor LA-HTM yw defnyddio laser i gynhesu'r sampl yn lleol o fewn maes golygfa'r microsgop (Ffig. 1a). I wneud hyn, rhaid i'r sampl fod yn amsugno golau. Er mwyn defnyddio pŵer laser rhesymol (llai na 100 mW), nid oeddem yn dibynnu ar amsugno golau gan y cyfrwng hylif, ond yn artiffisial cynyddodd amsugno'r sampl trwy orchuddio'r swbstrad â nanoronynnau aur (Ffig. 1c). Mae gwresogi nanoronynnau aur gyda golau o bwysigrwydd sylfaenol i faes plasmoneg thermol, gyda chymwysiadau disgwyliedig mewn biofeddygaeth, nanocemeg neu gynaeafu golau'r haul29,30,31. Dros yr ychydig flynyddoedd diwethaf, rydym wedi defnyddio'r LA-HTM hwn mewn sawl astudiaeth yn ymwneud â chymwysiadau plasma thermol mewn ffiseg, cemeg a bioleg. Y prif anhawster gyda'r dull hwn yw arddangos y proffil tymheredd terfynol, gan fod y tymheredd uchel wedi'i gyfyngu i ranbarth micro raddfa yn y sampl. Rydym wedi dangos y gellir cyflawni mapio tymheredd gyda'r ymyrrwr cneifio traws pedair tonfedd, sef dull syml, cydraniad uchel a sensitif iawn o ficrosgopeg cam meintiol yn seiliedig ar ddefnyddio rhwyllau diffreithiant dau ddimensiwn (a elwir hefyd yn gratiau croes) 33,34,35,36. Mae dibynadwyedd y dechneg microsgopeg thermol hon, sy'n seiliedig ar ficrosgopeg blaen y don gratio croes (CGM), wedi'i ddangos mewn dwsin o bapurau a gyhoeddwyd dros y degawd diwethaf37,38,39,40,41,42,43.
Cynllun gosod gwres laser cyfochrog, siapio a microsgop tymheredd. b Geometreg enghreifftiol sy'n cynnwys siambr AttofluorTM sy'n cynnwys slip gorchuddio wedi'i orchuddio â nanoronynnau aur. c Edrychwch yn ofalus ar y sampl (nid wrth raddfa). d cynrychioli'r proffil trawst laser unffurf ac (e) y dosbarthiad tymheredd dilynol efelychiedig ar blân sampl y nanoronynnau aur. Mae f yn broffil trawst laser annular sy'n addas ar gyfer cynhyrchu tymheredd unffurf fel y dangosir yn yr efelychiad o'r dosbarthiad tymheredd canlyniadol a ddangosir yn (g). Bar graddfa: 30 µm.
Yn benodol, rydym yn ddiweddar wedi llwyddo i wresogi celloedd mamalaidd gyda LA-HTM a CGM ac olrhain ymatebion sioc gwres cellog yn yr ystod o 37-42 ° C, gan ddangos cymhwysedd y dechneg hon i ddelweddu celloedd byw sengl. Fodd bynnag, nid yw cymhwyso LA-HTM i astudio micro-organebau ar dymheredd uchel yn ddiamwys, gan fod angen mwy o ofal o'i gymharu â chelloedd mamaliaid: yn gyntaf, gwresogi gwaelod y cyfrwng gan ddegau o raddau (yn hytrach nag ychydig raddau) yn arwain i raddiant tymheredd fertigol cryf. yn gallu creu darfudiad hylif 44 a all, os nad yw wedi'i gysylltu'n gadarn â'r swbstrad, achosi symudiad annymunol a chymysgu bacteria. Gellir dileu'r darfudiad hwn trwy leihau trwch yr haen hylif. I'r diben hwn, yn yr holl arbrofion a gyflwynir isod, gosodwyd ataliadau bacteriol rhwng dau orchuddion tua 15 µm o drwch wedi'u gosod y tu mewn i gwpan metel (AttofluorTM, Thermofisher, Ffig. 1b,c). Mewn egwyddor, gellir osgoi darfudiad os yw trwch yr hylif yn llai na maint trawst y laser gwresogi. Yn ail, gall gweithio mewn geometreg mor gyfyngedig fygu organebau aerobig (gweler Ffig. S2). Gellir osgoi'r broblem hon trwy ddefnyddio swbstrad sy'n athraidd i ocsigen (neu unrhyw nwy hanfodol arall), trwy adael swigod aer wedi'u dal y tu mewn i'r slip clawr, neu drwy ddrilio tyllau yn y clawr uchaf (gweler Ffig. S1) 45 . Yn yr astudiaeth hon, dewisom yr ateb olaf (Ffigurau 1b a S1). Yn olaf, nid yw gwresogi laser yn darparu dosbarthiad tymheredd unffurf. Hyd yn oed ar yr un dwyster y pelydr laser (Ffig. 1d), nid yw'r dosbarthiad tymheredd yn unffurf, ond yn hytrach yn debyg i'r dosbarthiad Gaussian oherwydd trylediad thermol (Ffig. 1e). Pan mai'r nod yw sefydlu tymereddau manwl gywir yn y maes golygfa ar gyfer astudio systemau biolegol, nid yw proffiliau anwastad yn ddelfrydol a gallant hefyd arwain at symudiad thermofforetig o facteria os nad ydynt yn cadw at y swbstrad (gweler Ffig. S3, S4)39. I'r perwyl hwn, gwnaethom ddefnyddio modulator golau gofodol (SLM) i siapio'r trawst laser isgoch yn ôl siâp y cylch (Ffig. 1f) yn awyren y sampl i gyflawni dosbarthiad tymheredd hollol unffurf o fewn ardal geometrig benodol, er gwaethaf trylediad thermol (Ffig. 1d) 39 , 42, 46. Rhowch slip clawr uchaf dros ddysgl fetel (Ffigur 1b) i osgoi anweddiad o'r cyfrwng a'i arsylwi am o leiaf ychydig ddyddiau. Oherwydd nad yw'r clawr uchaf hwn wedi'i selio, gellir ychwanegu cyfrwng ychwanegol yn hawdd ar unrhyw adeg os oes angen.
I ddangos sut mae LA-HTM yn gweithio a dangos ei gymhwysedd mewn ymchwil thermoffilig, astudiwyd y bacteria aerobig Geobacillus stearothermophilus, sydd â thymheredd twf optimwm o tua 60-65°C. Mae gan y bacteriwm hefyd flagella a'r gallu i nofio, gan ddarparu dangosydd arall o weithgaredd cellog arferol.
Cafodd samplau (Ffig. 1b) eu deori ymlaen llaw ar 60°C am awr ac yna eu rhoi mewn daliwr sampl LA-HTM. Mae'r cyn-deoriad hwn yn ddewisol, ond yn dal yn ddefnyddiol, am ddau reswm: Yn gyntaf, pan fydd y laser yn cael ei droi ymlaen, mae'n achosi i'r celloedd dyfu a rhannu ar unwaith (gweler ffilm M1 mewn Deunyddiau Atodol). Heb ddeor cyn, mae twf bacteriol fel arfer yn cael ei ohirio gan tua 40 munud bob tro y caiff man gwylio newydd ei gynhesu ar y sampl. Yn ail, roedd y cyn-deoriad 1 awr yn hyrwyddo adlyniad y bacteria i'r gorchuddion, gan atal celloedd rhag drifftio allan o'r maes golygfa oherwydd thermofforesis pan gafodd y laser ei droi ymlaen (gweler ffilm M2 yn Deunyddiau Atodol). Thermophoresis yw symudiad gronynnau neu foleciwlau ar hyd graddiant tymheredd, fel arfer o boeth i oerfel, ac nid yw bacteria yn eithriad43,47. Mae'r effaith annymunol hon yn cael ei dileu dros ardal benodol trwy ddefnyddio SLM i siapio'r trawst laser a chyflawni dosbarthiad tymheredd gwastad.
Ar ffig. Mae Ffigur 2 yn dangos y dosbarthiad tymheredd a fesurwyd gan CGM a gafwyd trwy arbelydru swbstrad gwydr wedi'i orchuddio â nanoronynnau aur gyda thrawst laser annular (Ffig. 1f). Gwelwyd dosbarthiad tymheredd gwastad dros yr ardal gyfan a gwmpesir gan y pelydr laser. Gosodwyd y parth hwn i 65 ° C, y tymheredd twf gorau posibl. Y tu allan i'r rhanbarth hwn, mae'r gromlin tymheredd yn disgyn yn naturiol i \(1/r\) (lle mae \(r\) yn gyfesuryn rheiddiol).
a Map tymheredd o fesuriadau CGM a gafwyd trwy ddefnyddio pelydr laser annular i arbelydru haen o nanoronynnau aur i gael proffil tymheredd gwastad dros ardal gylchol. b Isotherm o'r map tymheredd (a). Cynrychiolir cyfuchlin y trawst laser gan gylch dotiog llwyd. Ailadroddwyd yr arbrawf ddwywaith (gweler Deunyddiau Atodol, Ffigur S4).
Cafodd hyfywedd celloedd bacteriol ei fonitro am sawl awr gan ddefnyddio LA-HTM. Ar ffig. Mae 3 yn dangos yr egwyl amser ar gyfer pedair delwedd a gymerwyd o ffilm 3 awr 20 munud (Ffilm M3, Gwybodaeth Atodol). Gwelwyd bod bacteria yn amlhau'n weithredol o fewn yr ardal gylchol a ddiffinnir gan y laser lle'r oedd y tymheredd gorau posibl, yn agosáu at 65 ° C. Mewn cyferbyniad, gostyngwyd twf celloedd yn sylweddol pan ddisgynnodd y tymheredd o dan 50 ° C am 10 s.
Delweddau dyfnder optegol o facteria G. stearothermophilus yn tyfu ar ôl gwresogi laser ar wahanol adegau, (a) t = 0 mun, (b) 1 h 10 mun, (c) 2 h 20 mun, (d) 3 h 20 mun, allan o 200 Wedi'i dynnu o ffilm un funud (ffilm M3 wedi'i darparu mewn Gwybodaeth Atodol) wedi'i harosod ar y map tymheredd cyfatebol. Mae'r laser yn troi ymlaen ar amser \(t=0\). Mae isothermau wedi'u hychwanegu at y ddelwedd dwyster.
Er mwyn mesur twf celloedd ymhellach a'i ddibyniaeth ar dymheredd, fe wnaethom fesur y cynnydd mewn biomas o gytrefi amrywiol o facteria ynysig i ddechrau ym maes golygfa Movie M3 (Ffig. 4). Dangosir y bacteria rhiant a ddewiswyd ar ddechrau ffurfiad uned ffurfio cytrefi bach (mCFU) yn Ffigur S6. Cymerwyd mesuriadau màs sych gyda chamera CGM 48 a ddefnyddiwyd i fapio'r dosbarthiad tymheredd. Gallu'r CGM i fesur pwysau sych a thymheredd yw cryfder yr LA-HTM. Yn ôl y disgwyl, achosodd tymheredd uchel dwf bacteriol cyflymach (Ffig. 4a). Fel y dangosir yn y plot lled-log yn Ffig. 4b, mae twf ar bob tymheredd yn dilyn twf esbonyddol, lle mae'r data'n defnyddio'r ffwythiant esbonyddol \(m={m}_{0}{10}^{t/\tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), lle \(\tau {{{{\rm{log }}}}}}2\) – amser cenhedlaeth (neu amser dyblu), \( g =1/ \tau\) – cyfradd twf (nifer y rhaniadau fesul uned amser ). Ar ffig. Mae 4c yn dangos y gyfradd twf a'r amser cynhyrchu priodol fel swyddogaeth tymheredd. Mae mCFUs sy'n tyfu'n gyflym yn cael eu nodweddu gan dirlawnder twf ar ôl dwy awr, ymddygiad disgwyliedig oherwydd dwysedd bacteriol uchel (yn debyg i'r cyfnod llonydd mewn diwylliannau hylif clasurol). Mae'r siâp cyffredinol \(g\chwith(T\dde)\) (Ffig. 4c) yn cyfateb i'r gromlin dau gam ddisgwyliedig ar gyfer G. stearothermophilus gyda chyfradd twf optimaidd tua 60-65°C. Parwch y data gan ddefnyddio model cardinal (Ffigur S5)49 lle mae \(\ chwith({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}}}; ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, sy'n cytuno'n dda â gwerthoedd eraill a ddyfynnir yn y llenyddiaeth49. Er bod y paramedrau sy'n dibynnu ar dymheredd yn atgynhyrchadwy, gall y gyfradd twf uchaf o \({G}_{0}\) amrywio o un arbrawf i'r llall (gweler ffigurau S7-S9 a ffilm M4). Yn wahanol i baramedrau gosod tymheredd, a ddylai fod yn gyffredinol, mae'r gyfradd twf uchaf yn dibynnu ar briodweddau'r cyfrwng (argaeledd maetholion, crynodiad ocsigen) o fewn y geometreg microscale a arsylwyd.
a Twf microbaidd ar dymheredd amrywiol. mCFU: Unedau Ffurfio Trefedigaethau Bach. Data a gafwyd o fideo o un bacteriwm yn tyfu mewn graddiant tymheredd (ffilm M3). b Yr un fath ag (a), graddfa lled-logarithmig. c Cyfradd twf\(\tau\) ac amser cynhyrchu\(g\) wedi'u cyfrifo o atchweliad llinol (b). Bariau gwall llorweddol: ystod tymheredd yr ehangodd mCFUs drosto i faes yr olygfa yn ystod twf. Bariau gwall fertigol: gwall safonol atchweliad llinol.
Yn ogystal â thwf arferol, roedd rhai bacteria weithiau'n arnofio i'r golwg yn ystod gwresogi laser, sy'n ymddygiad disgwyliedig ar gyfer bacteria â flagella. Mae'r ffilm M5 mewn gwybodaeth ychwanegol yn dangos gweithgareddau nofio o'r fath. Yn yr arbrawf hwn, defnyddiwyd ymbelydredd laser unffurf i greu graddiant tymheredd, fel y dangosir yn Ffigurau 1d, e ac S3. Mae Ffigur 5 yn dangos dau ddilyniant delwedd a ddewiswyd o'r ffilm M5 sy'n dangos bod un bacteriwm yn dangos symudiad cyfeiriadol tra bod yr holl facteria eraill yn parhau'n llonydd.
Mae'r ddwy ffrâm amser (a) a (b) yn dangos nofio dau facteria gwahanol sydd wedi'u marcio â chylchoedd dotiog. Tynnwyd y delweddau o'r ffilm M5 (a ddarparwyd fel deunydd atodol).
Yn achos G. stearothermophilus, dechreuodd symudiad gweithredol bacteria (Ffig. 5) ychydig eiliadau ar ôl i'r pelydr laser gael ei droi ymlaen. Mae'r sylw hwn yn pwysleisio ymateb amserol y micro-organeb thermoffilig hwn i gynnydd mewn tymheredd, fel y gwelwyd eisoes gan Mora et al. 24 . Gellir ymchwilio ymhellach i bwnc symudedd bacteriol a hyd yn oed thermotaxis gan ddefnyddio LA-HTM.
Ni ddylid drysu rhwng nofio microbaidd a mathau eraill o fudiant corfforol, sef (i) mudiant brownaidd, sy'n ymddangos yn fudiant anhrefnus heb unrhyw gyfeiriad pendant, (ii) darfudiad 50 a thermofforesis 43, sy'n cynnwys symudiad cyson ar hyd tymheredd. graddiant.
Mae G. stearothermophilus yn adnabyddus am ei allu i gynhyrchu sborau hynod wrthiannol (ffurfiant sborau) pan fyddant yn agored i amodau amgylcheddol andwyol fel amddiffyniad. Pan ddaw amodau amgylcheddol yn ffafriol eto, mae'r sborau'n egino, gan ffurfio celloedd byw ac ailddechrau twf. Er bod y broses sbori/egino hon yn hysbys iawn, ni welwyd erioed mewn amser real. Gan ddefnyddio LA-HTM, rydym yn adrodd yma am yr arsylwad cyntaf o ddigwyddiadau egino yn G. stearothermophilus.
Ar ffig. Mae 6a yn dangos delweddau treigl amser o ddyfnder optegol (OT) a gafwyd gan ddefnyddio set CGM o 13 sbôr. Am yr amser casglu cyfan (15 h 6 min, \(t=0\) - dechrau gwresogi laser), roedd 4 allan o 13 o sborau'n egino, ar bwyntiau amser olynol \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' a \(11\) h \(30\)'. Er mai dim ond un o'r digwyddiadau hyn a ddangosir yn Ffigur 6, gellir arsylwi 4 digwyddiad egino yn y ffilm M6 yn y deunydd atodol. Yn ddiddorol, mae'n ymddangos bod egino yn hap: nid yw pob sbôr yn egino ac nid ydynt yn egino ar yr un pryd, er gwaethaf yr un newidiadau mewn amodau amgylcheddol.
a Cyfnod treigl amser yn cynnwys 8 delwedd OT (trochi olew, 60x, amcan 1.25 NA) a (b) esblygiad biomas o agregau stearothermophilus G.. c (b) Wedi'i luniadu ar raddfa hanner log i amlygu llinoledd y gyfradd twf (llinell doriad).
Ar ffig. Mae 6b,c yn dangos biomas poblogaethau celloedd ym maes gweld fel swyddogaeth amser dros y cyfnod cyfan o gasglu data. Pydredd cyflym y màs sych a welwyd ar \(t=5\)h yn ffig. 6b, c, oherwydd ymadawiad rhai celloedd o'r maes golygfa. Cyfradd twf y pedwar digwyddiad hyn yw \(0.77\pm 0.1\) h-1. Mae'r gwerth hwn yn uwch na'r gyfradd twf sy'n gysylltiedig â Ffigur 3. 3 a 4, lle mae celloedd yn tyfu fel arfer. Mae'r rheswm dros y cynnydd yn y gyfradd twf G. stearothermophilus o sborau yn aneglur, ond mae'r mesuriadau hyn yn amlygu diddordeb LA-HTM ac yn gweithio ar lefel cell sengl (neu ar lefel sengl mCFU) i ddysgu mwy am ddeinameg bywyd celloedd .
Er mwyn dangos ymhellach amlbwrpasedd LA-HTM a'i berfformiad ar dymheredd uchel, fe wnaethom archwilio twf Sulfolobus shibatae, archaea asidoffilig hyperthermophilic gyda thymheredd twf optimwm o 80 ° C51. O'u cymharu â G. stearothermophilus, mae gan yr archaea hyn forffoleg wahanol iawn hefyd, sy'n debyg i sfferau 1 micron (cocci) yn hytrach na gwiail hirgul (bacilli).
Mae Ffigur 7a yn cynnwys delweddau dyfnder optegol dilyniannol o S. shibatae mCFU a gafwyd gan ddefnyddio CGM (gweler ffilm nodwedd M7 yn Deunyddiau Atodol). Mae'r mCFU hwn yn tyfu tua 73 ° C, yn is na'r tymheredd gorau posibl o 80 ° C, ond o fewn yr ystod tymheredd ar gyfer twf gweithredol. Gwelsom ddigwyddiadau ymholltiad lluosog a wnaeth i mCFUs edrych fel micrograpes o archaea ar ôl ychydig oriau. O'r delweddau therapi galwedigaethol hyn, cafodd biomas mCFU ei fesur dros amser a'i gyflwyno yn Ffigur 7b. Yn ddiddorol, dangosodd mCFUs S. shibatae dwf llinol yn hytrach na'r twf esbonyddol a welwyd gyda G. stearothermophilus mCFUs. Bu trafodaeth hirsefydlog 52 am natur cyfraddau twf celloedd: er bod rhai astudiaethau'n nodi cyfraddau twf microbau sy'n gymesur â'u maint (twf esbonyddol), mae eraill yn dangos cyfradd gyson (twf llinellol neu ddeuol). Fel yr eglurwyd gan Tzur et al.53, mae gwahaniaethu rhwng twf esbonyddol a (bi)linellol yn gofyn am gywirdeb o <6% mewn mesuriadau biomas, sydd allan o gyrraedd ar gyfer y rhan fwyaf o dechnegau QPM, hyd yn oed yn ymwneud â interferometreg. Fel yr eglurwyd gan Tzur et al.53, mae gwahaniaethu rhwng twf esbonyddol a (bi)linellol yn gofyn am gywirdeb o <6% mewn mesuriadau biomas, sydd allan o gyrraedd ar gyfer y rhan fwyaf o dechnegau QPM, hyd yn oed yn ymwneud â interferometreg. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует томноста, зличение что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Fel yr eglurwyd gan Zur et al.53, mae gwahaniaethu rhwng twf esbonyddol a (bi)linellol yn gofyn am <6% o gywirdeb mewn mesuriadau biomas, sy'n anghyraeddadwy ar gyfer y rhan fwyaf o ddulliau QPM, hyd yn oed gan ddefnyddio interferometreg.Fel yr eglurwyd gan Zur et al. 53, mae gwahaniaethu rhwng twf esbonyddol a (bi)linellol yn gofyn am lai na 6% o gywirdeb mewn mesuriadau biomas, sy'n anghyraeddadwy ar gyfer y rhan fwyaf o ddulliau QPM, hyd yn oed pan ddefnyddir interferometreg. Mae CGM yn cyflawni'r cywirdeb hwn gyda chywirdeb is-pg mewn mesuriadau biomas36,48.
a Amser-treiddiad yn cynnwys 6 delwedd OT (trochi olew, 60x, amcan NA 1.25) a (b) esblygiad biomas micro-CFU wedi'i fesur gyda CGM. Gweler ffilm M7 am ragor o wybodaeth.
Roedd twf unionlin S. shibatae yn annisgwyl ac nid yw wedi cael ei adrodd eto. Fodd bynnag, disgwylir twf esbonyddol, o leiaf oherwydd dros amser, rhaid i raniadau lluosog o gelloedd 2, 4, 8, 16 … ddigwydd. Fe wnaethom ddamcaniaethu y gallai twf llinellol fod o ganlyniad i ataliad celloedd oherwydd pacio celloedd trwchus, yn union fel y mae twf celloedd yn arafu ac yn y pen draw yn cyrraedd cyflwr segur pan fo dwysedd celloedd yn rhy uchel.
Rydym yn cloi trwy drafod y pum pwynt o ddiddordeb canlynol yn eu tro: gostyngiad mewn cyfaint gwresogi, gostyngiad mewn syrthni thermol, diddordeb mewn nanoronynnau aur, diddordeb mewn microsgopeg cyfnod meintiol, ac ystod tymheredd posibl y gellir defnyddio LA-HTM ynddo.
O'i gymharu â gwresogi gwrthiannol, mae gwresogi laser a ddefnyddir ar gyfer datblygiad HTM yn cynnig nifer o fanteision, yr ydym yn eu dangos yn yr astudiaeth hon. Yn benodol, mewn cyfryngau hylif ym maes golwg y microsgop, cedwir y cyfaint gwresogi o fewn ychydig (10 μm) 3 cyfrol. Yn y modd hwn, dim ond y microbau a arsylwyd sy'n weithredol, tra bod bacteria eraill yn segur a gellir eu defnyddio i astudio'r sampl ymhellach - nid oes angen newid y sampl bob tro y mae angen gwirio tymheredd newydd. Yn ogystal, mae gwresogi micro raddfa yn caniatáu archwiliad uniongyrchol o ystod eang o dymheredd: Cafwyd Ffigur 4c o ffilm 3 awr (Ffilm M3), sydd fel arfer yn gofyn am baratoi ac archwilio sawl sampl - un ar gyfer pob un o'r samplau dan sylw. y yw'r tymheredd sy'n cynrychioli nifer y dyddiau yn yr arbrawf. Mae lleihau'r cyfaint gwresogi hefyd yn cadw holl gydrannau optegol y microsgop o amgylch, yn enwedig y lens gwrthrychol, ar dymheredd yr ystafell, sydd wedi bod yn broblem fawr a wynebwyd gan y gymuned hyd yn hyn. Gellir defnyddio LA-HTM gydag unrhyw lens, gan gynnwys lensys trochi olew, a bydd yn aros ar dymheredd ystafell hyd yn oed gyda thymheredd eithafol yn y maes golygfa. Prif gyfyngiad y dull gwresogi laser yr ydym yn adrodd arno yn yr astudiaeth hon yw y gall celloedd nad ydynt yn glynu neu'n arnofio fod ymhell o'r maes golygfa ac yn anodd eu hastudio. Un ateb posibl fyddai defnyddio lensys chwyddo isel i sicrhau cynnydd tymheredd mwy o fwy nag ychydig gannoedd o ficronau. Ynghyd â'r rhybudd hwn mae gostyngiad mewn cydraniad gofodol, ond os mai'r nod yw astudio symudiad micro-organebau, nid oes angen cydraniad gofodol uchel.
Mae'r raddfa amser ar gyfer gwresogi (ac oeri) y system \({{{{\rm{\tau }}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) yn dibynnu ar ei maint , yn ôl y gyfraith \({{{{\rm{\tau }}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), lle \n (L\ ) yw maint nodweddiadol y ffynhonnell wres (diamedr y trawst laser yn ein hastudiaeth yw \(L\ tua 100 \) μm), \(D\) yw trylededd thermol yr amgylchedd (cyfartaledd yn ein cas, gwydr a dŵr Cyfradd trylediad\(D\ tua 2\plyg {10}^{-7}\) m2/s). newidiadau tymheredd, gellir ei ddisgwyl.
Mae ein dull arfaethedig yn berthnasol i unrhyw swbstrad sy'n amsugno golau (er enghraifft, samplau masnachol gyda gorchudd ITO). Fodd bynnag, mae nanoronynnau aur yn gallu darparu amsugno uchel yn yr is-goch ac amsugno isel yn yr ystod weladwy, y mae eu nodweddion olaf o ddiddordeb ar gyfer arsylwi optegol effeithiol yn yr ystod weladwy, yn enwedig wrth ddefnyddio fflworoleuedd. Yn ogystal, mae aur yn fiogydnaws, yn gemegol anadweithiol, gellir addasu dwysedd optegol o 530 nm i bron isgoch, ac mae paratoi sampl yn syml ac yn economaidd29.
Mae microsgopeg blaen tonnau gratio ardraws (CGM) yn caniatáu nid yn unig mapio tymheredd ar y raddfa ficro, ond hefyd monitro biomas, gan ei wneud yn arbennig o ddefnyddiol (os nad oes angen) ar y cyd â LA-HTM. Dros y degawd diwethaf, mae technegau microsgopeg tymheredd eraill wedi'u datblygu, yn enwedig ym maes bioddelweddu, ac mae'r rhan fwyaf ohonynt yn gofyn am ddefnyddio chwilwyr fflwroleuol sy'n sensitif i dymheredd54,55. Fodd bynnag, mae'r dulliau hyn wedi'u beirniadu ac mae rhai adroddiadau wedi mesur newidiadau tymheredd afrealistig o fewn celloedd, o bosibl oherwydd bod fflworoleuedd yn dibynnu ar lawer o ffactorau heblaw tymheredd. Yn ogystal, mae'r rhan fwyaf o stilwyr fflwroleuol yn ansefydlog ar dymheredd uchel. Felly, mae QPM ac yn arbennig CGM yn dechneg microsgopeg tymheredd delfrydol ar gyfer astudio bywyd ar dymheredd uchel gan ddefnyddio microsgopeg optegol.
Mae astudiaethau o S. shibatae, sy'n byw yn optimaidd ar 80°C, yn dangos y gellir defnyddio LA-HTM i astudio hyperthermophiles, nid dim ond thermoffiliau syml. Mewn egwyddor, nid oes terfyn ar yr ystod o dymereddau y gellir eu cyrraedd gan ddefnyddio LA-HTM, a gellir cyrraedd tymereddau uwch na 100 ° C hyd yn oed ar bwysau atmosfferig heb ferwi, fel y dangosir gan ein grŵp o 38 mewn cymwysiadau cemeg hydrothermol yn yr atmosffer. pwysedd A. Defnyddir laser ar gyfer gwresogi nanoronynnau aur 40 yn yr un modd. Felly, mae gan LA-HTM y potensial i gael ei ddefnyddio i arsylwi hyperthermoffiliau digynsail gyda microsgopeg optegol cydraniad uchel safonol o dan amodau safonol (hy dan straen amgylcheddol).
Perfformiwyd yr holl arbrofion gan ddefnyddio microsgop cartref, gan gynnwys goleuo Köhler (gyda LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), deiliad sbesimen gyda symudiad xy llaw, amcanion (Olympus, 60x, 0.7 NA, aer, LUCPlanFLN60X neu 60x, 1.25 NA, Olew , UPLFLN60XOI), camera CGM (gratio croes QLSI, traw 39 µm, 0.87 mm o synhwyrydd camera Andor Zyla) i ddarparu delweddu dwyster a tonfedd, a chamera sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modd 16-did, o Hamamatsu) i gofnodi'r data a ddangosir yn Ffigur 5 (nofio bacteriol). Mae'r holltwr trawst deucroig yn ymyl BrightLine 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). Mae'r hidlydd ar flaen y camera yn hidlydd pas byr 694 (FF02-694 / SP-25, Semrock). Laser saffir titaniwm (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, ceudod laser tswnami wedi'i bwmpio, Spectra-Physics yn Ffig. 2-5, wedi'i ddisodli ymhellach gan laser Millenia, Spectraphysics 10 W, pwmpio ceudod laser Mira, Cydlynol, ar gyfer Ffig. 2 -5). 6 a 7) wedi'u gosod i'r donfedd \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, sy'n cyfateb i sbectrwm cyseiniant plasmon o nanoronynnau aur. Modulators golau gofodol (1920 × 1152 picsel) gan Meadowlark Optics Cyfrifwyd yr hologramau gan ddefnyddio algorithm Gerchberg-Saxton fel y disgrifir yn y ddolen 39.
Mae microsgopeg blaen ton croes gratio (CGM) yn dechneg microsgopeg optegol sy'n seiliedig ar gyfuno gratio diffreithiant dau-ddimensiwn (a elwir hefyd yn gratio croes) bellter o un milimedr oddi wrth synhwyrydd camera confensiynol. Gelwir yr enghraifft fwyaf cyffredin o CGM yr ydym wedi'i ddefnyddio yn yr astudiaeth hon yn interferomedr sifft traws pedair tonfedd (QLSI), lle mae'r croes-gratio yn cynnwys patrwm bwrdd gwirio dwyster/cyfnod a gyflwynwyd ac a batentiwyd gan Primot et al. yn 200034. Mae'r llinellau gratio fertigol a llorweddol yn creu cysgodion tebyg i grid ar y synhwyrydd, a gellir prosesu'r ystumiad yn rhifiadol mewn amser real i gael afluniad optegol blaen y don (neu broffil cyfnod cyfatebol) y golau digwyddiad. Pan gaiff ei ddefnyddio ar ficrosgop, gall camera CGM arddangos gwahaniaeth llwybr optegol gwrthrych delweddedig, a elwir hefyd yn ddyfnder optegol (OT), gyda sensitifrwydd ar drefn nanometr36. Mewn unrhyw fesuriad CGM, er mwyn dileu unrhyw ddiffygion yn y cydrannau optegol neu'r trawstiau, rhaid tynnu delwedd OT cyfeirio sylfaenol o unrhyw ddelweddau dilynol.
Perfformiwyd microsgopeg tymheredd gan ddefnyddio camera CGM fel y disgrifir yn y cyfeirnod. 32. Yn fyr, mae gwresogi hylif yn newid ei fynegai plygiannol, gan greu effaith lens thermol sy'n ystumio'r trawst digwyddiad. Mae'r afluniad blaen ton hwn yn cael ei fesur gan y CGM a'i brosesu gan ddefnyddio algorithm deconvolution i gael dosbarthiad tymheredd tri dimensiwn yn y cyfrwng hylif. Os yw'r nanoronynnau aur wedi'u dosbarthu'n gyfartal trwy'r sampl, gellir mapio tymheredd mewn ardaloedd di-bacteria i gynhyrchu delweddau gwell, a dyna rydyn ni'n ei wneud weithiau. Cafwyd y ddelwedd gyfeirnod CGM heb wres (gyda'r laser i ffwrdd) ac yna fe'i daliwyd yn yr un lleoliad yn y ddelwedd gyda'r laser ymlaen.
Cyflawnir mesuriad màs sych gan ddefnyddio'r un camera CGM a ddefnyddir ar gyfer delweddu tymheredd. Cafwyd delweddau cyfeirio CGM trwy symud y sampl yn gyflym yn x ac y yn ystod datguddiad fel ffordd o gyfartaleddu unrhyw anhomogenedd yn yr OT oherwydd presenoldeb bacteria. O ddelweddau OT o facteria, cafwyd eu biomas gan ddefnyddio ensemble o ddelweddau dros ardaloedd a ddewiswyd gan ddefnyddio algorithm segmentu cartref Matlab (gweler yr isadran “Cod rhifiadol”), gan ddilyn y weithdrefn a ddisgrifir yn cyf. 48. Yn fyr, rydym yn defnyddio'r perthynas \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\chwith(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), lle mae \({{\mbox{OT}}}\chwith(x,y\right)\) yn ddelwedd dyfnder optegol, \(m\) yw mae'r pwysau sych a \({{{{\rm{\alpha }}}}}\) yn gysonyn. Dewiswyd \({{{{\rm{\alpha)))))=0.18\) µm3/pg, sy'n gysonyn nodweddiadol ar gyfer celloedd byw.
Rhoddwyd slip gorchudd 25 mm mewn diamedr a 150 µm o drwch wedi'i orchuddio â nanoronynnau aur mewn siambr AttofluorTM (Thermofisher) gyda'r nanoronynnau aur yn wynebu i fyny. Cafodd Geobacillus stearothermophilus ei ragddiwyllio dros nos mewn cyfrwng LB (200 rpm, 60 ° C) cyn pob diwrnod o arbrofion. Gosodwyd diferyn o 5 µl crogiant o G. stearothermophilus gyda dwysedd optegol (OD) o 0.3 i 0.5 ar slip clawr gyda nanoronynnau aur. Yna, cafodd slip clawr crwn 18 mm mewn diamedr gyda thwll 5 mm mewn diamedr yn y canol ei ollwng ar y gostyngiad, a chymhwyswyd 5 μl o ataliad bacteriol gyda'r un dwysedd optegol dro ar ôl tro i ganol y twll. Paratowyd y ffynhonnau ar y clawr yn unol â'r weithdrefn a ddisgrifir yn cyf. 45 (gweler Gwybodaeth Atodol am ragor o wybodaeth). Yna ychwanegwch 1 ml o gyfrwng LB i'r clawr i atal yr haen hylif rhag sychu. Rhoddir y slip gorchuddio olaf dros gaead caeedig siambr Attofluor™ i atal y cyfrwng rhag anweddu yn ystod y cyfnod magu. Ar gyfer arbrofion egino, fe wnaethom ddefnyddio sborau, a oedd weithiau, ar ôl arbrofion confensiynol, yn gorchuddio'r slip gorchuddio uchaf. Defnyddiwyd dull tebyg i gael Sulfolobus shibatae. Cynhaliwyd tri diwrnod (200 rpm, 75 ° C) o amaethu rhagarweiniol Thiobacillus serrata mewn cyfrwng 182 (DSMZ).
Paratowyd samplau o nanoronynnau aur gan lithograffeg copolymer bloc micellar. Disgrifir y broses hon yn fanwl ym Mhennod. 60. Yn gryno, cafodd micelles sy'n amgáu ïonau aur eu syntheseiddio trwy gymysgu'r copolymer â HAuCl4 mewn tolwen. Yna cafodd y gorchuddion wedi'u glanhau eu trochi yn yr hydoddiant a'u trin ag arbelydru UV ym mhresenoldeb cyfrwng rhydwytho i gael hadau aur. Yn olaf, tyfwyd hadau aur trwy gysylltu â gorchuddion â hydoddiant dyfrllyd o KAuCl4 ac ethanolamine am 16 munud, a arweiniodd at drefniant lled-gyfnodol ac unffurf iawn o nanoronynnau aur ansfferig yn yr isgoch agos.
I drosi'r interferogramau i ddelweddau OT, fe wnaethom ddefnyddio algorithm cartref, fel y manylir yn y ddolen. 33 ac mae ar gael fel pecyn Matlab yn yr ystorfa gyhoeddus ganlynol: https://github.com/baffou/CGMprocess. Gall y pecyn gyfrifo dwyster a delweddau OT yn seiliedig ar interferogramau wedi'u recordio (gan gynnwys delweddau cyfeirio) a phellteroedd araeau camera.
I gyfrifo'r patrwm cam a gymhwyswyd i SLM i gael proffil tymheredd penodol, defnyddiwyd algorithm cartref39,42 a ddatblygwyd yn flaenorol gennym sydd ar gael yn yr ystorfa gyhoeddus ganlynol: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Y mewnbwn yw'r maes tymheredd dymunol, y gellir ei osod yn ddigidol neu drwy ddelwedd bmp unlliw.
Er mwyn segmentu'r celloedd a mesur eu pwysau sych, gwnaethom ddefnyddio ein algorithm Matlab a gyhoeddwyd yn yr ystorfa gyhoeddus ganlynol: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Ar bob delwedd, rhaid i'r defnyddiwr glicio ar y bacteria neu'r mCFU o ddiddordeb, addasu sensitifrwydd y ffon, a chadarnhau'r dewis.
I gael rhagor o wybodaeth am gynllun yr astudiaeth, gweler crynodeb yr Adroddiad Ymchwil Natur sy'n gysylltiedig â'r erthygl hon.
Mae data sy'n cefnogi canlyniadau'r astudiaeth hon ar gael gan yr awduron priodol ar gais rhesymol.
Manylir ar y cod ffynhonnell a ddefnyddiwyd yn yr astudiaeth hon yn yr adran Dulliau, a gellir lawrlwytho fersiynau dadfygio o https://github.com/baffou/ yn yr ystorfeydd canlynol: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, a CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Cipolwg ar thermoffiliau a'u cymwysiadau sbectrwm eang. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Cipolwg ar thermoffiliau a'u cymwysiadau sbectrwm eang.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. a Sharma, AK Trosolwg o thermoffiliau a'u cymhwysiad eang. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. a Sharma AK Dealltwriaeth ddofn o thermoffiliau ac ystod eang o gymwysiadau.3 Biotechnoleg 6, 81 (2016).
Amser post: Medi-26-2022